心力衰竭（Heart failure, HF）是高血压、冠心病、心肌病、心瓣膜病等各种心脏病的严重阶段，是众多心血管疾病的终末转归。心力衰竭病人已经成为心血管疾病临床住院病人的主要来源，其发病率高，5年存活率低，与恶性肿瘤相仿。心力衰竭的治疗已经成为病人、医生和医疗保健系统的重荷。有效的治疗心力衰竭对降低心血管疾病的致残率、致死率都具有重要的意义。目前心力衰竭的常规药物治疗是联合使用3大类药物，即利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂（Angiotensin-Converting Enzyme Inhibitor, ACEI）和β受体阻滞剂。利尿剂在心力衰竭治疗中起着基础和关键的作用，其控制和缓解心力衰竭症状“立竿见影”，是其他任一有效“生物学治疗”的基础。目前，在心力衰竭治疗中使用的经典利尿剂在发挥利尿作用的同时常常会引起低血压、以低钾血症为代表的电解质紊乱和降低肾血流量和降低肾小球滤过率（glomerular filtration rate,GFR），诱发或加重肾功能损害，最终影响到对心力衰竭的临床治疗效果，甚至威胁到病人的生命。因此，具有良好利尿作用并能维持电解质稳态、且具有保护心力衰竭患者肾功能的新型利尿药物成为利尿药研发的重要方向。近年来，随着对心力衰竭病理生理学和基于利尿药药理学研究的快速进展，使开发基于新作用机制的利尿药物成为可能。腺苷受体（Adenosine Receptor,AR）阻断剂已经成为研制抗心力衰竭的利尿药物的新方向。腺苷受体阻断剂用于治疗心力衰竭的优势主要表现为此类药物通过阻断腺苷A₁受体（A₁Adenosine Receptor, A₁R）发挥利尿作用，同时能够调节肾血管舒缩功能，改善肾血流灌注从而保护肾脏功能。腺苷激活腺苷A₁受体导致肾小球入球小动脉收缩，从而降低肾小球滤过率；同时，腺苷还可刺激肾小球旁器的肾素促进血管紧张素Ⅱ的产生，加重入球小动脉收缩，导致肾小球滤过率的进一步下降。在动物以及人体试验中发现阻断肾脏中腺苷A₁受体不会影响肾小管功能，并可通过改善肾小球血流量和阻断肾小管球间反馈（tubuloglomerular feedback,TGF）从而改善肾小球滤过功能。因此，腺苷受体阻断剂不仅具有维持电解质稳态同时发挥排钠排水的利尿作用，更能够通过调节肾脏血管舒缩状态，改善肾脏血流灌注，从而提高肾小球滤过率，进而保护肾脏功能。腺苷受体阻断剂依据化学结构不同进行划分，包括黄嘌呤类和非黄嘌呤类两大类。目前的腺苷受体阻断剂以黄嘌呤类居多。黄嘌呤类腺苷受体阻断剂由于其母核结构单一，对分子结构多样性的变化有较大的限制，导致在药代动力学性质优化、高亲和力和高选择性化合物的化学合成筛选方面存在明显的局限性。而非黄嘌呤类腺苷受体阻断剂由于化学母核结构的多样性、组织选择性高的优势，已经成为腺苷受体阻断剂研发的新趋势。鉴于以上研究背景，本课题旨在针对自主研发的2-（3-氟苯基）-4-正丁氨基吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮衍生物进行筛选，获得高亲和力、高选择性，具有明确利尿肾功能保护作用且药代动力学性质较为理想的新型非黄嘌呤类腺苷A₁受体阻断剂。本研究的主要发现包括：一、筛选获得高亲和力、高选择性新型非黄嘌呤类腺苷受体阻断剂首先，我们建立了稳定表达人源A₁R的CHO-K1细胞株和稳定表达人源A₂AR的HEK-293细胞株。在大鼠脑组织和稳定表达腺苷受体的细胞体系中，采用放射配体受体竞争实验，在两个（10-5、10-7M）浓度下，对30个2-（3-氟苯基）-4-正丁氨基吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮衍生物进行筛选，获得8个对A₁R具有高亲和力的化合物。在此基础上，用定量药理学的方法获得了这8个化合物和标记配体竞争性与A₁R结合的Ki值。PQ-69（0.955nM）、 PQ-81（46.5nM）、PQ-83（0.90nM）、PQ-85（1.57nM）、PQ-86（7.07nM）、PQ-88（55.8nM）、PQ-103（1.54nM）、PQ-107（1.07nM）；它们对A₂AR的Ki值分别为：PQ-69（208nM）、PQ-81（67.8nM）、PQ-83（109nM）、PQ-85（52.6nM）、PQ-86（247nM）、PQ-88（1240nM）、PQ-103（154nM）、PQ-107（170nM）。A₁R/A₂AR的选择倍数分别为PQ-69（217倍）、PQ-81（1.46倍）、PQ-83（120倍）、PQ-85（33.6倍）、PQ-86（35倍）、PQ-88（22.2倍）、PQ-103（99.9倍）、PQ-107（159倍）。同时在已建立的表达多种G-蛋白偶联受体（G-protein Coupled Receptors, GPCR）的稳定细胞系上比较了该类化合物对其他GPCR受体的亲和力，发现该类化合物对多巴胺D1、D2、D3受体，胆碱M4、M5受体，肾上腺素α1A、α1B受体的亲和力均较低，对A₁R的选择倍数都大于1000倍。与文献报道的非黄嘌呤类腺苷受体阻断剂相比，该类化合物属于高亲和力和高选择性的化合物，尤其是PQ-69和PQ-83。PQ-69和PQ-83对A₁R的亲和力和选择性与文献报道已知的高选择性A₁R阻断剂1,3-Dipropyl-8-cyclopentyl xanthine （DPCPX）相当或略高。 PQ-69、 PQ-83、DPCPX对A₁R的Ki值分别为：0.955、0.9、1.9nM； A₁R/A₂AR的选择倍数为208、109、52.6倍。其次，通过[35S]-GTPγS（guanosine-5-O-（3-[35S] thio） triphosphate）结合实验在G蛋白分子水平上证实2-（3-氟苯基）-4-正丁氨基吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮衍生物本身不能激动A₁R，是A₁R的阻断剂。此外，我们还发现PQ-69和PQ-83能够降低[35S]-GTPγS的基础结合量，提示他们具有反向激动A₁R的特点。进一步通过检测G蛋白激活后第二信使环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）的变化，确证PQ-69和PQ-83兼具A₁R阻断剂和反向激动剂的特性。此外，我们还在豚鼠离体气管条上评价了PQ-69和PQ-83阻断A₁R激动剂的作用强度。结果发现，PQ-69和PQ-83可以浓度依赖性地显著抑制A₁R激动剂2-Chloro-N6-cyclopentyladenosine （CCPA）收缩气管条的作用，拮抗CCPA的作用强，拮抗活性与选择性A₁R阻断剂DPCPX相当。 PQ-69、PQ-83和DPCPX的pA₂值分别为8.99、9.54、8.11；SchildSlope值分别为1.3、1.1、1.2。而且，PQ-69（10-10-10-6M）自身能浓度依赖性地舒张静息状态的离体气管条，拮抗内源性腺苷对气管条的收缩作用。因此，PQ-69和PQ-83在离体组织水平表现出竞争性A₁R阻断剂的特点。二、PQ-69和PQ-83早期药代动力学研究通过计算机预测药代动力学性质，表明2（-3-氟苯基）-4-正丁氨基吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮衍生物的溶解性质、吸收性质良好。在此基础上，本文进一步对PQ-69、PQ-83及选择性A₁R阻断剂DPCPX的药代动力学性质进行研究。在大鼠上，静脉（intravenous, i.v.）和灌胃（per os, p.o.）给予PQ-69，其半衰期明显长于PQ-83和DPCPX，静脉半衰期分别为7.92、3.71、2.36小时；灌胃半衰期分别为9.69、3.16、5.85小时；在大鼠和人肝微粒体模型中，PQ-69和PQ-83孵育60min后剩余量均大于70%，与阳性化合物DPCPX相比，代谢缓慢，性质稳定；在Caco-2细胞模型上，PQ-69的透膜性质优于PQ-83。这些实验结果提示PQ-69的药代动力学性质明显优于DPCPX。三、PQ-69早期急性毒性研究对PQ-69进行初步的早期毒性研究，5只雄性小鼠灌胃给予PQ-69（840mg/kg），未出现死亡，14天后未表现任何不良反应；7只小鼠灌胃给予PQ-69（2100mg/kg），其中3只雄性鼠，4只雌性鼠均未发生死亡，14天后未表现任何不良反应。四、PQ-69在正常大鼠及顺铂所致急性肾功能衰竭大鼠利尿及肾功能保护作用1、PQ-69（30mg/kg, p.o.）能够显著增加正常大鼠尿量（P﹤0.001）；PQ-69（10mg/kg, p.o.）能够显著增加大鼠钠离子排泄（P﹤0.05）。PQ-69（0.03、0.3、1、3mg/kg, i.v.）能够剂量依赖地显著增加大鼠尿量，PQ-69（0.3mg/kg, i.v.）与氢氯噻嗪（Hydrochlorothiazide, HCTZ）（1mg/kg, i.v.）及DPCPX（1mg/kg, i.v.）增加尿量相当，均能明显增加大鼠尿量；PQ-69（0.03、0.3、1、3mg/kg, i.v.）剂量依赖性的显著增加钠离子、氯离子排泄，与高效利尿剂呋塞米（Furosemide，FURO）（6mg/kg, i.v.）、中效利尿剂氢氯噻嗪（1mg/kg, i.v.）既显著增加钠离子、氯离子排泄，同时又显著增加钾离子排泄相比，PQ-69静脉给药对钾离子排泄影响较小，提示PQ-69在发挥利尿，增加钠离子、氯离子排泄作用的同时能够较少影响钾离子排泄，维持电解质的平衡。2、在顺铂（5mg/kg, i.v.）致急性肾功能衰竭大鼠模型上，PQ-69（10、30mg/kg,p.o.）与模型组相比呈现增加大鼠尿量趋势。与高效利尿剂FURO（30mg/kg, p.o.）、中效利尿剂HCTZ（3mg/kg, p.o.）不能改善顺铂造成的大鼠肌酐清除率显著降低不同，PQ-69（3、10、30mg/kg, p.o.）能够恢复大鼠肌酐清除率至正常水平，提示PQ-69具有利尿和肾功能保护作用。3、在顺铂（4mg/kg, i.v.）致急性肾功能衰竭大鼠模型上，PQ-69（0.01、0.1、1mg/kg, i.v.）与DPCPX（0.1、1mg/kg, i.v.）均能剂量依赖地显著增加大鼠尿量和钠离子、氯离子排泄（P﹤0.05）。与高效利尿剂FURO（6mg/kg, i.v.）显著增加钾离子排泄相比，DPCPX（1mg/kg, i.v.）和PQ-69（0.01、0.1、1mg/kg, i.v.）对钾离子排泄都没有影响。此外，高效利尿剂FURO（6mg/kg, i.v.）、中效利尿剂HCTZ（1mg/kg, i.v.）对模型大鼠肌酐清除率显著降低没有明显改善作用，而PQ-69（0.1mg/kg, P﹤0.05）、DPCPX（0.1mg/kg, P﹤0.05）与模型组相比，能显著增加大鼠肌酐清除率，提示PQ-69在发挥利尿、增加钠离子、氯离子排泄作用的同时能够不影响钾离子排泄，维持电解质平衡，增加肌酐清除率，具有肾功能保护作用。4、通过对肾脏病理形态学进行分析，发现顺铂（4mg/kg, i.v.）导致大鼠出现病理损伤，肾皮质明显变薄，肾小管上皮细胞肿胀，偶见远曲小管蛋白管形，但肾髓质中肾小球结构基本正常。PQ-69（0.1mg/kg, i.v.）与DPCPX（0.1mg/kg,i.v.）相比，能够改善模型组大鼠肾脏皮质变薄、近曲小管上皮细胞肿胀等病理损伤。通过实时定量PCR方法检测肾脏A₁R和A₂AR的mRNA表达水平，顺铂（4mg/kg, i.v.）能显著增加大鼠A₁R（P﹤0.001）和A₂AR（P﹤0.05）mRNA的表达。通过蛋白免疫印迹法检测肾脏A₁R、A₂AR的表达，顺铂（4mg/kg, i.v.）造成大鼠肾脏A₁R、A₂AR蛋白含量表达有增加的趋势，提示PQ-69抗顺铂所致肾功能损伤作用可能是通过阻断或部分阻断A₁R的表达上调实现。综上所述，本研究通过筛选获得了具有自主知识产权的高亲和力、高选择性的2-（3-氟苯基）-4-正丁氨基吡唑并[4，3-c]喹啉-3-酮结构的A₁R阻断剂，其中PQ-69对A₁R亲和力和选择性较高。通过进行体外、离体及体内的系统研究发现PQ-69兼具A₁R阻断剂及反向激动剂的特点；在离体水平对A₁R激动剂的拮抗作用强；PQ-69的药代动力学性质良好，半衰期长，稳定性好。在正常大鼠和顺铂所致急性肾功能衰竭大鼠模型上，静脉给予PQ-69具有较强的利尿、维持电解质平衡、保护肾功能的作用。PQ-69抗顺铂所致急性肾功能衰竭作用可能是通过阻断或部分阻断表达上调的A₁R实现的。