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Nanog基因并非只表达在胚胎干细胞中,在多种肿瘤细胞中也检测到了Nanog基因的表达,这就提示我们,肿瘤细胞中高水平表达的Nanog蛋白是被重新异常激活的,那么这种激活对于肿瘤的发生尤其是对于一些肿瘤因子的作用值得探讨。Smad3是TGF-β信号通路家族中重要一个信号分子,参与多种肿瘤信号通路,Smad3也可以和其他因子相互作用,Smad3家族的协同作用在TGF-β信号通路中的作用是关键的。Wnt3是另外一个重要的细胞因子,主要参与Wnt信号通路并参与其他多种信号通路,而且在肿瘤中也有表达。Boyer预测Nanog在Wnt3上游8kb之内可能有结合位点。为了推测Nanog在肿瘤发生中的作用,有必要探明Nanog与Smad3和Wnt3之间的作用。实验方法:首先建立体外高表达Nanog的CHO细胞系,还有转入空载体pcDNA3.1的对照细胞系,为随后的荧光报告检测做准备。筛选基因,设计Smad3,Wnt3以及内参的实时定量引物,提取高表达Nanog的293f细胞总RNA,反转录后检测高表达Nanog的细胞中相应的Smad3和Wnt3是否也在高表达。确定以上基因相对于照细胞表达明显升高之后,设计其上游调控序列的引物,确定载体构建成功后,将其克隆入PGL-3-basic荧光报告载体中。共转染CHO或293细胞,并检测其荧光表达的变化,从而研究Nanog对这些基因的调控效果。结果:荧光定量PCR检测到高表达Nanog的同时,293f细胞也在同时高表达上述被测基因,提示Nanog对这些基因具有调控作用,同时荧光报告基因结果显示调控不是直接的。应该是通过其他途径进行的。结论:成功构建了体外高表达Nanog的CHO细胞系,为将来进行体外高表达模型提供了方便的工具,而且通过实时PCR和荧光报告基因技术,验证了Nanog对上述基因具有调控关系,但是何种调控通路还需深入研究。