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研究背景
微生物组(microbiota)，又称菌群，是人体微环境的重要组成部分，主要分布在肠道、皮肤、口腔、呼吸道、生殖道等器官中。菌群与机体存在共生的关系，其变化可在一定程度上影响着人体生理、病理功能的改变。传统的观念一直认为“正常人的尿道与尿液是无菌的”，对泌尿系统细菌的认识主要停留在一些能引起泌尿系统感染的病原菌上。这种观念形成的主要原因是基于以常规细菌培养的方式来诊断尿路感染(urinary tract infections，UTIs)。然而，近年来随着高通量测序技术的发展及细菌培养方式的改进，已有多项研究证实正常人尿道中存在特定的微生物群落(菌群)，从而提出“泌尿系统菌群”这一崭新概念。进一步的研究发现，泌尿系统菌群的改变与急迫性尿失禁、膀胱过度活动症和前列腺癌等多种泌尿系统疾病密切相关。
越来越多的证据表明，菌群在癌症的发生和发展中起着重要的作用，其中研究最为深入的是肠道菌群与结直肠癌的关系，具核梭杆菌导致结直肠癌发生发展的分子机制逐步被人们所认知。近年来，肿瘤自身菌群的研究也逐渐成为微生物组学领域研究的热点之一。2019年8月，Cell杂志发表的论文揭示了胰腺癌肿瘤菌群的多样性与患者存活率以及肠道菌群的关系(Cell，2019，178(4):795-806)。2020年3月，美国加州大学RobKnight团队通过分析TCGA数据库里的18116个样本，在包括膀胱癌在内的33种癌症组织中发现了一定的细菌序列，并认为检测组织和血液中的微生物可以作为癌症诊断的全新方法(Nature，2020，579(7800):567-574)。2020年5月，Science杂志更是以封面文章的形式发表了关于肿瘤菌群的论文。该研究首次对肿瘤菌群进行了全面分析，研究了包括乳腺癌，肺癌，卵巢癌等在内的1526例肿瘤及癌旁组织，发现每种肿瘤都有其独特的菌群组成。肿瘤细菌大部分在细胞内，并且存在于癌细胞和免疫细胞中(Science，2020，368(6494):973-980)。由于肿瘤自身菌群的含量相对较少和研究方法的局限性，比起肠道菌群，我们对肿瘤菌群分布及功能的了解还不够深入。然而，系统化的肿瘤菌群研究正在迅速改变我们对肿瘤以及菌群的认识，我们也正好有幸见证着一个重要领域的兴起与发展，以上研究为今后肿瘤菌群领域的研究提供了坚实基础以及新的方向。
膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，其发病率在我国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中占据第一位，且具有容易复发的特点，严重威胁人民群众生命健康。经研究证实，非洲曼氏血吸虫感染在膀胱鳞状细胞癌的发生发展中起了重要作用，这被认为是微生物与膀胱癌之间最早的联系。男性膀胱癌的发病率是女性的3～4倍，有多项研究证实尿液菌群的多样性在男女性别之间也存在显著的差异。卡介苗灌注是非肌层浸润性膀胱癌的标准一线治疗方法，可以有效减少膀胱癌术后复发，而卡介苗本身是牛分枝杆菌的减毒活菌体，它能够抑制肿瘤复发并不仅仅因为能激活人体免疫系统，也可能因为它作为外来优势菌株打破了原本有利于癌细胞发生发展的膀胱微生态环境。因此，我们推测膀胱癌患者的泌尿系统菌群可能存在独特的菌群组成和微生物群落结构的多样性，本研究将通过尿液和组织两个层面来研究膀胱癌患者的泌尿系统菌群，然后进一步探讨可培养的“差异细菌”对膀胱癌细胞生物学功能的影响。
首先，本研究利用16SrDNA高通量测序研究膀胱癌患者尿液菌群和正常对照的组成特征及其多样性，同时采用尿液增强定量尿液培养(Enhanced quantitative urine culture，EQUC)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)来分析膀胱癌患者尿液与正常对照之间存在哪些可培养的“差异细菌”。为了进一步证实膀胱癌组织中菌群的存在，我们设计合成了细菌共有保守序列16SrDNA荧光探针，利用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测膀胱癌与癌旁组织中菌群的表达，并通过16SrDNA高通量测序来分析膀胱癌与癌旁组织中菌群的组成特征和多样性。通过分析膀胱癌患者与正常对照尿液16SrDNA测序数据和EQUC尿液培养结果，我们选择大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌(分别是革兰阳性菌、阴性菌和厌氧菌)等在膀胱癌患者与正常对照之间统计学差异最为显著的可培养细菌，分别与人膀胱移行细胞癌细胞T24、人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1构建共培养模型，分析上述三种差异细菌对膀胱癌细胞的增殖、迁徙、侵袭、细胞周期及细胞凋亡的影响。
此外，本研究16SrDNA测序结果表明膀胱癌患者与正常对照尿液中存在很多种“不可培养细菌”(Uncultured Bacteria)，这些细菌在目前在常规培养条件下无法繁殖生长，即不可培养。我们在课题研究过程中也对利用MALDI-TOFMS直接鉴定尿液细菌的方法进行了探索，通过尿液的差速离心浓缩分离得到细菌蛋白，从而越过细菌培养这一阶段，试图经过质谱分析直接鉴定出膀胱癌患者与正常对照尿液中的不可培养细菌。同时，本研究将该方法转化应用到临床微生物检验的日常工作中，以期建立一种基于质谱技术的尿液细菌直接鉴定和快速药敏的整合方案。
第一部分膀胱癌患者尿液增强定量培养质谱鉴定与尿液菌群特征分析
目的:
探寻膀胱癌患者与正常对照尿液菌群的组成特征和多样性差异，并通过EQUC增强定量培养和MALDI-TOFMS质谱鉴定以发现两组间的差异细菌。
方法:
利用术前插管导尿的方式收集膀胱癌患者的中段尿，并以骨科外伤患者为对照。采用EQUC增强定量尿液培养对膀胱癌患者组及对照组尿液样品进行培养，通过MALDI-TOFMS进行鉴定。经膜过滤技术后利用试剂盒提取尿液样本微生物组总DNA，采用16SrDNAV4区引物进行双末端测序;利用α多样性(Alpha Diversity)和β多样性(Beta Diversity)研究样本中的菌群物种组成和两组样本间的群落结构差异。
结果:
1.两组尿液样本均成功检测到细菌DNA序列，稀释曲线和RankAbundance曲线显示测序效果良好，两种曲线在当前测序深度上基本趋于平稳，表明绝大多数的细菌种类已经被检测到。
2.在门水平上，膀胱癌患者和正常对照组尿液中的菌群以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门等为主。
3.膀胱癌组的Observedspecies指数、ACE指数和Chao1指数平均值均大于对照组(P＜0.05)，说明膀胱癌患者尿液菌群的丰富度要比对照组高。Simpson指数和Shannon指数均显示膀胱癌患者尿液菌群的多样性均大于对照组(P＜0.05)。PCoA、PCA和NMDS分析结果显示，膀胱癌组和对照组各样本分别聚到一起，表明二者有不同的微生物群落，差异具有统计学意义。
4.EQUC增强定量尿液培养和MALDI-TOFMS质谱分析结果显示:两组尿液共培养出腐生大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌、乳杆菌等21种细菌。经16SrDNA测序挖掘得到乳杆菌、棒状杆菌、大肠埃希菌等两组间的差异细菌，经EQUC方案可在膀胱癌患者及对照组尿液中培养分离出来。
结论:
1.通过EQUC尿液培养方案，膀胱癌患者和对照组尿液中培养出大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌，乳杆菌等多种细菌。
2.尿液样本16SrDNA测序数据证实，膀胱癌患者和对照组尿液中均可以检测到菌群的存在，两组尿液样本中丰度最高的细菌物种为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门。
3.膀胱癌患者与对照组相比，其尿液菌群发生明显改变，有着不同的尿液菌群组成和群落特征，膀胱癌患者尿液菌群的丰富度和多样性均高于对照组。
4.16SrDNA测序数据分析得到的两组间可培养的差异细菌，经EQUC方案可在膀胱癌患者及对照组尿液中培养分离出来，一致性较好，EQUC方案进一步拓展了尿液培养组学的方法。
第二部分膀胱癌与癌旁组织菌群荧光原位杂交验证及组织菌群特征分析
目的:
在组织学层面进一步证实膀胱癌与癌旁组织中菌群的存在，研究膀胱癌与癌旁组织菌群的组成特征和多样性差异。
方法:
术中无菌采集膀胱癌患者癌组织及癌旁组织，设计16SrDNA(EBU338)荧光探针，利用FISH技术对膀胱癌和癌旁组织进行细菌荧光原位杂交，同时利用膀胱粘膜标志物Mucin-1和平滑肌标志物α-SMA进行免疫荧光实验，从而对膀胱组织中的细菌分布进行精准定位。利用试剂盒提取微生物组总DNA，采用16SrDNAV4区通用引物并基于IlluminaNovaSeq测序平台进行双末端测序，对测序数据进行物种注释及丰度分析;利用α多样性和β多样性分析揭示样本中物种组成和样本间群落结构的差异。
结果:
1.FISH实验结果表明，膀胱癌组织及膀胱癌旁组织中均直接检测到细菌的存在，利用膀胱粘膜标志物Mucin-1的免疫荧光实验结果证实，在膀胱癌与膀胱癌旁组织的粘膜外层、粘膜层和粘膜下层均可观察到细菌，且细菌在粘膜外层分布最多。采用平滑肌标志物α-SMA的免疫荧光实验结果证实，不仅在粘膜层，在膀胱肌层检测到细菌的存在。
2.膀胱癌与癌旁组织样本16SrDNA高通量测序结果显示，膀胱癌与癌旁组织样本中相对丰度最高的细菌物种为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门。在α多样性研究中，膀胱癌组的Observedspecies指数、ACE指数和Chao1指数平均值分别小于癌旁组织组，但经wilcox检验显示P值均＞0.05，说明两组间菌群丰富度的差异没统计学意义;膀胱癌组Shannon和Simpson指数平均值均小于癌旁组织组，经wilcox检验显示P值均＞0.05，说明两组间菌群α多样性的差异也没有统计学意义。
3.在β多样性研究中，PCoA、PCA和NMDS分析的结果均标明，膀胱癌组与癌旁组织组的多数样本距在一起，说明两个组间的微生物群落组成结构的差异性很小，二者具有相似的微生物群落结构。基于WeightedUnifrac距离的Wilcoxon检验显示，膀胱癌组与癌旁组织组间差异的P值为0.072，没有统计学意义，说明膀胱癌组与癌旁组织组的β多样性差异不显著。
4.LEfSe分析结果显示，膀胱癌组中具有统计学差异的物种在属水平为葡萄球菌属，而癌旁组织组中没有分析到具有统计学差异的物种。
结论:
1.膀胱癌组织和癌旁组织中均可以检测到细菌，与EQUC尿液培养的阳性结果相一致。细菌存在于膀胱癌与膀胱癌旁组织的粘膜外层、粘膜层、粘膜下层甚至平滑肌层，且细菌在粘膜外层分布最多。
2.膀胱癌与癌旁组织样本中相对丰度最高的细菌物种为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门，与膀胱癌患者尿液菌群的组成结果相一致。
3.与癌旁组织相比，膀胱癌组织菌群存在较低的物种丰富度和多样性，但这些差异没有统计学意义;膀胱癌组织与癌旁组织有着相似的菌群群落结构。
4.在属水平上，膀胱癌组中具有统计学差异的物种为葡萄球菌属。
第三部分差异细菌对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期、凋亡的影响
目的:
利用第一部分和第二部分筛选出的大肠埃希菌、脆弱拟杆菌和腐生葡萄球菌等可培养的差异细菌，与膀胱癌细胞和人永生化膀胱上皮细胞进行共培养，探究其对两种细胞的增殖、迁移、侵袭能力及凋亡的影响。
方法:
取T24细胞、SV-HUC-1细胞分别与腐生葡萄球菌、大肠埃希菌、脆弱拟杆菌进行共培养，采用CCK8实验、划痕实验、Transwell实验及AnnexinⅤ-FITC/PI双标流式细胞学实验检测两种细菌对T24细胞、SV-HUC-1细胞的增殖、迁移、侵袭能力及细胞周期、细胞凋亡的影响。
结果:
1.在MOI=500接种密度下，大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌对T24细胞和SV-HUC-1细胞的影响较大，细胞数目明显减少，细胞形态发生变化，贴壁生长的细胞数量减少，当MOI=100时，三种差异细菌分布与T24细胞核SV-HUC-1细胞共培养，细胞形态没有发生明显变化，仍能贴壁生长。
2.在MOI=100条件下，相比于空白对照组，大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌均对T24细胞增殖产生抑制作用;对于SV-HUC-1细胞，大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌对其增殖不产生影响。
3.在MOI=100条件下，相比于空白对照组，T24细胞与大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌共培养24小时，细胞迁移率明显降低，且差异有统计学意义。SV-HUC-1细胞分别与大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌分别共培养24小时后，细胞迁移率与空白对照组相比均无明显差异。
4.在MOI=100条件下，相比于空白对照组，三种差异细菌与T24细胞孵育后，Transwell下室中细胞数目减少，差异具有统计学意义。
5.在MOI=100条件下，与空白对照组相比，大肠埃希菌与T24细胞孵育24小时，造成T24细胞的G1期延长，S期缩短。腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌与T24细胞培养后对细胞周期的影响较小。三种差异细胞与SV-HUC-1细胞共培养后对细胞周期影响较小，差异无统计学意义。三种细菌与T24细胞共培养后，T24细胞的凋亡率与正常对照组相比，差异无统计学意义。三种差异细胞与SV-HUC-1细胞共培养对细胞凋亡率的影响较小，差异无统计学意义。
结论:
1.利用课题前期筛选出的大肠埃希菌、脆弱拟杆菌和腐生葡萄球菌等可培养的差异细菌，与T24膀胱癌细胞和SV-HUC-1人永生化膀胱上皮细胞进行共培养，当MOI=100时，两种细胞形态未发生明显变化，细胞仍在贴壁生长，成功构建三种差异细菌与两种细胞的共培养模型。
2.大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌对T24细胞的增殖、迁移和侵袭具有抑制作用，大肠埃希菌可抑制T24细胞分裂。对SV-HUC-1细胞，大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌对其增殖和迁移不产生影响。三种差异细菌对T24和SV-HUC-1细胞的凋亡不产生影响。
3.我们推测膀胱癌相关差异细菌对膀胱癌细胞生物学功能的抑制作用可能与膀胱癌微生态环境里的人体宿主反应有关，人体可能通过一系列的免疫杀伤反应筛选出对膀胱癌发生发展具有抑制作用的共生菌，使其在膀胱及尿液中的丰度升高，从而起到抑制膀胱癌细胞的作用。
第四部分膀胱癌尿液不可培养细菌的质谱直接鉴定及拓展应用研究
目的:
利用MALDI-TOFMS技术对膀胱癌患者尿液中不可培养细菌进行直接鉴定，探讨该方法的可行性，并将该方法拓展应用于尿路感染患者尿液细菌的直接鉴定和快速药敏。
方法:
1.建立差速离心直接浓缩分离病原菌的方法，将膀胱癌患者尿液进行差速离心，分离浓缩病原菌，评估所建立方法的分离效果。
2.将所分离浓缩的膀胱癌患者细菌沉淀物进行MALDI-TOFMS直接鉴定。
3.利用尿液流式UF-1000i技术筛查尿路感染患者，确定尿液病原菌浓度的cut-off值。
4.将所分离浓缩的病原菌沉淀物进行MALDI-TOFMS直接鉴定和VITEK2快速药敏，评估直接鉴定和快速药敏与常规尿液培养方法的符合率，及该方法的周转时间(Turn-around Time，TAT)。
结果:
1.所建立的差速离心方法对革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌都取得较好的分离浓缩效果，细胞及其碎片被有效去除。
2.MALDI-TOFMS对膀胱癌与正常对照浓缩分离后的细菌沉淀物可获得部分蛋白峰，但基于现有的细菌质谱数据库，不能够得到有效分析，未能直接鉴定出不可培养细菌。
3.通过对1638个尿液样本进行UF-1000i筛选，确定尿液病原菌浓度cut-off值为≥5000细菌/μl。在1638个尿液样本中，病原菌浓度≥5000细菌/μl的尿液样本有307个，其中265个(86.32％)为单菌生长，适合下一步进行MS直接鉴定，16个为双菌生长，22个培养为污染，4个培养阴性;＜5000细菌/μl的尿液样本有1331个，其中98个单菌生长，6个双菌生长，即总体漏检率为6.35％(104/1638)。
4.利用本MALDI-TOFMS直接鉴定方法对184例革兰阴性杆菌感染的尿液样本进行了直接鉴定，有163例(88.59％)的质谱鉴定得分高于2，17例(9.24％)的得分为1.7-2，而得分低于1.7仅有4例(2.17％)。在163例鉴定到种的革兰氏阴性杆菌中，大肠埃希菌的鉴定符合率为98.01％(99/101)，肺炎克雷伯菌为97.22％(35/36)，其余例如变形杆菌、铜绿假单胞菌等符合率均为100％。在15个葡萄球菌感染尿液样本中，有14个(93.33％)获得了可靠直接鉴定，而在51个肠球菌属样本中，只有32个(62.75％)被可靠鉴定。在9个念珠菌样品中，仅2个在属水平上被直接鉴定，效果较差。
5.对72例肠杆菌目尿液样本一共做了1296项药敏测试，两种方法之间的整体类别一致率为94.83％(11229/1296)，小错误率为4.17％(54/1296)，大错误率为0.92％(12/1296)，极大错误率为0.08％(1/1296)。在18例革兰氏阴性非发酵菌的样品中，共进行了378次药敏测试，整体类别一致率为94.44％(357/378)，小错误率为2.91％(11/378)，大错误率为1.59％(6/378)，极大错误率为1.06％(4/378)。在10例葡萄球菌的样品中共进行了160次药敏测试，总体类别一致率为94.38％(151/160),小错误率为3.12％(5/160)，大错误率为1.87％(3/160)，极大错误率为0.63％(1/160)。
6.利用所建立的尿液流式-质谱-VITEK方法进行直接鉴定和快速药敏的TAT时间缩短至6-24h。
结论:
1.所建立差速离心法可以浓缩分离尿液细菌，对膀胱癌与正常对照尿液细菌沉淀物进行质谱分析可获得蛋白峰，但基于现有细菌质谱数据库的鉴定效果较差，未能直接鉴定出不可培养细菌。
2.该方法能够用于尿路感染患者细菌的质谱直接鉴定和VITEK系统快速药敏，整体一致率较高。
3.所建立的尿液流式-质谱-VITEK方法对革兰阴性杆菌直接鉴定和快速药敏的TAT时间缩短至6-24h。
微生物组(microbiota)，又称菌群，是人体微环境的重要组成部分，主要分布在肠道、皮肤、口腔、呼吸道、生殖道等器官中。菌群与机体存在共生的关系，其变化可在一定程度上影响着人体生理、病理功能的改变。传统的观念一直认为“正常人的尿道与尿液是无菌的”，对泌尿系统细菌的认识主要停留在一些能引起泌尿系统感染的病原菌上。这种观念形成的主要原因是基于以常规细菌培养的方式来诊断尿路感染(urinary tract infections，UTIs)。然而，近年来随着高通量测序技术的发展及细菌培养方式的改进，已有多项研究证实正常人尿道中存在特定的微生物群落(菌群)，从而提出“泌尿系统菌群”这一崭新概念。进一步的研究发现，泌尿系统菌群的改变与急迫性尿失禁、膀胱过度活动症和前列腺癌等多种泌尿系统疾病密切相关。
越来越多的证据表明，菌群在癌症的发生和发展中起着重要的作用，其中研究最为深入的是肠道菌群与结直肠癌的关系，具核梭杆菌导致结直肠癌发生发展的分子机制逐步被人们所认知。近年来，肿瘤自身菌群的研究也逐渐成为微生物组学领域研究的热点之一。2019年8月，Cell杂志发表的论文揭示了胰腺癌肿瘤菌群的多样性与患者存活率以及肠道菌群的关系(Cell，2019，178(4):795-806)。2020年3月，美国加州大学RobKnight团队通过分析TCGA数据库里的18116个样本，在包括膀胱癌在内的33种癌症组织中发现了一定的细菌序列，并认为检测组织和血液中的微生物可以作为癌症诊断的全新方法(Nature，2020，579(7800):567-574)。2020年5月，Science杂志更是以封面文章的形式发表了关于肿瘤菌群的论文。该研究首次对肿瘤菌群进行了全面分析，研究了包括乳腺癌，肺癌，卵巢癌等在内的1526例肿瘤及癌旁组织，发现每种肿瘤都有其独特的菌群组成。肿瘤细菌大部分在细胞内，并且存在于癌细胞和免疫细胞中(Science，2020，368(6494):973-980)。由于肿瘤自身菌群的含量相对较少和研究方法的局限性，比起肠道菌群，我们对肿瘤菌群分布及功能的了解还不够深入。然而，系统化的肿瘤菌群研究正在迅速改变我们对肿瘤以及菌群的认识，我们也正好有幸见证着一个重要领域的兴起与发展，以上研究为今后肿瘤菌群领域的研究提供了坚实基础以及新的方向。
膀胱癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一，其发病率在我国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中占据第一位，且具有容易复发的特点，严重威胁人民群众生命健康。经研究证实，非洲曼氏血吸虫感染在膀胱鳞状细胞癌的发生发展中起了重要作用，这被认为是微生物与膀胱癌之间最早的联系。男性膀胱癌的发病率是女性的3～4倍，有多项研究证实尿液菌群的多样性在男女性别之间也存在显著的差异。卡介苗灌注是非肌层浸润性膀胱癌的标准一线治疗方法，可以有效减少膀胱癌术后复发，而卡介苗本身是牛分枝杆菌的减毒活菌体，它能够抑制肿瘤复发并不仅仅因为能激活人体免疫系统，也可能因为它作为外来优势菌株打破了原本有利于癌细胞发生发展的膀胱微生态环境。因此，我们推测膀胱癌患者的泌尿系统菌群可能存在独特的菌群组成和微生物群落结构的多样性，本研究将通过尿液和组织两个层面来研究膀胱癌患者的泌尿系统菌群，然后进一步探讨可培养的“差异细菌”对膀胱癌细胞生物学功能的影响。
首先，本研究利用16SrDNA高通量测序研究膀胱癌患者尿液菌群和正常对照的组成特征及其多样性，同时采用尿液增强定量尿液培养(Enhanced quantitative urine culture，EQUC)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)来分析膀胱癌患者尿液与正常对照之间存在哪些可培养的“差异细菌”。为了进一步证实膀胱癌组织中菌群的存在，我们设计合成了细菌共有保守序列16SrDNA荧光探针，利用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测膀胱癌与癌旁组织中菌群的表达，并通过16SrDNA高通量测序来分析膀胱癌与癌旁组织中菌群的组成特征和多样性。通过分析膀胱癌患者与正常对照尿液16SrDNA测序数据和EQUC尿液培养结果，我们选择大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌(分别是革兰阳性菌、阴性菌和厌氧菌)等在膀胱癌患者与正常对照之间统计学差异最为显著的可培养细菌，分别与人膀胱移行细胞癌细胞T24、人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1构建共培养模型，分析上述三种差异细菌对膀胱癌细胞的增殖、迁徙、侵袭、细胞周期及细胞凋亡的影响。
此外，本研究16SrDNA测序结果表明膀胱癌患者与正常对照尿液中存在很多种“不可培养细菌”(Uncultured Bacteria)，这些细菌在目前在常规培养条件下无法繁殖生长，即不可培养。我们在课题研究过程中也对利用MALDI-TOFMS直接鉴定尿液细菌的方法进行了探索，通过尿液的差速离心浓缩分离得到细菌蛋白，从而越过细菌培养这一阶段，试图经过质谱分析直接鉴定出膀胱癌患者与正常对照尿液中的不可培养细菌。同时，本研究将该方法转化应用到临床微生物检验的日常工作中，以期建立一种基于质谱技术的尿液细菌直接鉴定和快速药敏的整合方案。
第一部分膀胱癌患者尿液增强定量培养质谱鉴定与尿液菌群特征分析
目的:
探寻膀胱癌患者与正常对照尿液菌群的组成特征和多样性差异，并通过EQUC增强定量培养和MALDI-TOFMS质谱鉴定以发现两组间的差异细菌。
方法:
利用术前插管导尿的方式收集膀胱癌患者的中段尿，并以骨科外伤患者为对照。采用EQUC增强定量尿液培养对膀胱癌患者组及对照组尿液样品进行培养，通过MALDI-TOFMS进行鉴定。经膜过滤技术后利用试剂盒提取尿液样本微生物组总DNA，采用16SrDNAV4区引物进行双末端测序;利用α多样性(Alpha Diversity)和β多样性(Beta Diversity)研究样本中的菌群物种组成和两组样本间的群落结构差异。
结果:
1.两组尿液样本均成功检测到细菌DNA序列，稀释曲线和RankAbundance曲线显示测序效果良好，两种曲线在当前测序深度上基本趋于平稳，表明绝大多数的细菌种类已经被检测到。
2.在门水平上，膀胱癌患者和正常对照组尿液中的菌群以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门等为主。
3.膀胱癌组的Observedspecies指数、ACE指数和Chao1指数平均值均大于对照组(P＜0.05)，说明膀胱癌患者尿液菌群的丰富度要比对照组高。Simpson指数和Shannon指数均显示膀胱癌患者尿液菌群的多样性均大于对照组(P＜0.05)。PCoA、PCA和NMDS分析结果显示，膀胱癌组和对照组各样本分别聚到一起，表明二者有不同的微生物群落，差异具有统计学意义。
4.EQUC增强定量尿液培养和MALDI-TOFMS质谱分析结果显示:两组尿液共培养出腐生大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌、乳杆菌等21种细菌。经16SrDNA测序挖掘得到乳杆菌、棒状杆菌、大肠埃希菌等两组间的差异细菌，经EQUC方案可在膀胱癌患者及对照组尿液中培养分离出来。
结论:
1.通过EQUC尿液培养方案，膀胱癌患者和对照组尿液中培养出大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌，乳杆菌等多种细菌。
2.尿液样本16SrDNA测序数据证实，膀胱癌患者和对照组尿液中均可以检测到菌群的存在，两组尿液样本中丰度最高的细菌物种为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门。
3.膀胱癌患者与对照组相比，其尿液菌群发生明显改变，有着不同的尿液菌群组成和群落特征，膀胱癌患者尿液菌群的丰富度和多样性均高于对照组。
4.16SrDNA测序数据分析得到的两组间可培养的差异细菌，经EQUC方案可在膀胱癌患者及对照组尿液中培养分离出来，一致性较好，EQUC方案进一步拓展了尿液培养组学的方法。
第二部分膀胱癌与癌旁组织菌群荧光原位杂交验证及组织菌群特征分析
目的:
在组织学层面进一步证实膀胱癌与癌旁组织中菌群的存在，研究膀胱癌与癌旁组织菌群的组成特征和多样性差异。
方法:
术中无菌采集膀胱癌患者癌组织及癌旁组织，设计16SrDNA(EBU338)荧光探针，利用FISH技术对膀胱癌和癌旁组织进行细菌荧光原位杂交，同时利用膀胱粘膜标志物Mucin-1和平滑肌标志物α-SMA进行免疫荧光实验，从而对膀胱组织中的细菌分布进行精准定位。利用试剂盒提取微生物组总DNA，采用16SrDNAV4区通用引物并基于IlluminaNovaSeq测序平台进行双末端测序，对测序数据进行物种注释及丰度分析;利用α多样性和β多样性分析揭示样本中物种组成和样本间群落结构的差异。
结果:
1.FISH实验结果表明，膀胱癌组织及膀胱癌旁组织中均直接检测到细菌的存在，利用膀胱粘膜标志物Mucin-1的免疫荧光实验结果证实，在膀胱癌与膀胱癌旁组织的粘膜外层、粘膜层和粘膜下层均可观察到细菌，且细菌在粘膜外层分布最多。采用平滑肌标志物α-SMA的免疫荧光实验结果证实，不仅在粘膜层，在膀胱肌层检测到细菌的存在。
2.膀胱癌与癌旁组织样本16SrDNA高通量测序结果显示，膀胱癌与癌旁组织样本中相对丰度最高的细菌物种为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门。在α多样性研究中，膀胱癌组的Observedspecies指数、ACE指数和Chao1指数平均值分别小于癌旁组织组，但经wilcox检验显示P值均＞0.05，说明两组间菌群丰富度的差异没统计学意义;膀胱癌组Shannon和Simpson指数平均值均小于癌旁组织组，经wilcox检验显示P值均＞0.05，说明两组间菌群α多样性的差异也没有统计学意义。
3.在β多样性研究中，PCoA、PCA和NMDS分析的结果均标明，膀胱癌组与癌旁组织组的多数样本距在一起，说明两个组间的微生物群落组成结构的差异性很小，二者具有相似的微生物群落结构。基于WeightedUnifrac距离的Wilcoxon检验显示，膀胱癌组与癌旁组织组间差异的P值为0.072，没有统计学意义，说明膀胱癌组与癌旁组织组的β多样性差异不显著。
4.LEfSe分析结果显示，膀胱癌组中具有统计学差异的物种在属水平为葡萄球菌属，而癌旁组织组中没有分析到具有统计学差异的物种。
结论:
1.膀胱癌组织和癌旁组织中均可以检测到细菌，与EQUC尿液培养的阳性结果相一致。细菌存在于膀胱癌与膀胱癌旁组织的粘膜外层、粘膜层、粘膜下层甚至平滑肌层，且细菌在粘膜外层分布最多。
2.膀胱癌与癌旁组织样本中相对丰度最高的细菌物种为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门，与膀胱癌患者尿液菌群的组成结果相一致。
3.与癌旁组织相比，膀胱癌组织菌群存在较低的物种丰富度和多样性，但这些差异没有统计学意义;膀胱癌组织与癌旁组织有着相似的菌群群落结构。
4.在属水平上，膀胱癌组中具有统计学差异的物种为葡萄球菌属。
第三部分差异细菌对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期、凋亡的影响
目的:
利用第一部分和第二部分筛选出的大肠埃希菌、脆弱拟杆菌和腐生葡萄球菌等可培养的差异细菌，与膀胱癌细胞和人永生化膀胱上皮细胞进行共培养，探究其对两种细胞的增殖、迁移、侵袭能力及凋亡的影响。
方法:
取T24细胞、SV-HUC-1细胞分别与腐生葡萄球菌、大肠埃希菌、脆弱拟杆菌进行共培养，采用CCK8实验、划痕实验、Transwell实验及AnnexinⅤ-FITC/PI双标流式细胞学实验检测两种细菌对T24细胞、SV-HUC-1细胞的增殖、迁移、侵袭能力及细胞周期、细胞凋亡的影响。
结果:
1.在MOI=500接种密度下，大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌对T24细胞和SV-HUC-1细胞的影响较大，细胞数目明显减少，细胞形态发生变化，贴壁生长的细胞数量减少，当MOI=100时，三种差异细菌分布与T24细胞核SV-HUC-1细胞共培养，细胞形态没有发生明显变化，仍能贴壁生长。
2.在MOI=100条件下，相比于空白对照组，大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌均对T24细胞增殖产生抑制作用;对于SV-HUC-1细胞，大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌对其增殖不产生影响。
3.在MOI=100条件下，相比于空白对照组，T24细胞与大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌共培养24小时，细胞迁移率明显降低，且差异有统计学意义。SV-HUC-1细胞分别与大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌分别共培养24小时后，细胞迁移率与空白对照组相比均无明显差异。
4.在MOI=100条件下，相比于空白对照组，三种差异细菌与T24细胞孵育后，Transwell下室中细胞数目减少，差异具有统计学意义。
5.在MOI=100条件下，与空白对照组相比，大肠埃希菌与T24细胞孵育24小时，造成T24细胞的G1期延长，S期缩短。腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌与T24细胞培养后对细胞周期的影响较小。三种差异细胞与SV-HUC-1细胞共培养后对细胞周期影响较小，差异无统计学意义。三种细菌与T24细胞共培养后，T24细胞的凋亡率与正常对照组相比，差异无统计学意义。三种差异细胞与SV-HUC-1细胞共培养对细胞凋亡率的影响较小，差异无统计学意义。
结论:
1.利用课题前期筛选出的大肠埃希菌、脆弱拟杆菌和腐生葡萄球菌等可培养的差异细菌，与T24膀胱癌细胞和SV-HUC-1人永生化膀胱上皮细胞进行共培养，当MOI=100时，两种细胞形态未发生明显变化，细胞仍在贴壁生长，成功构建三种差异细菌与两种细胞的共培养模型。
2.大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌对T24细胞的增殖、迁移和侵袭具有抑制作用，大肠埃希菌可抑制T24细胞分裂。对SV-HUC-1细胞，大肠埃希菌、腐生葡萄球菌、脆弱拟杆菌对其增殖和迁移不产生影响。三种差异细菌对T24和SV-HUC-1细胞的凋亡不产生影响。
3.我们推测膀胱癌相关差异细菌对膀胱癌细胞生物学功能的抑制作用可能与膀胱癌微生态环境里的人体宿主反应有关，人体可能通过一系列的免疫杀伤反应筛选出对膀胱癌发生发展具有抑制作用的共生菌，使其在膀胱及尿液中的丰度升高，从而起到抑制膀胱癌细胞的作用。
第四部分膀胱癌尿液不可培养细菌的质谱直接鉴定及拓展应用研究
目的:
利用MALDI-TOFMS技术对膀胱癌患者尿液中不可培养细菌进行直接鉴定，探讨该方法的可行性，并将该方法拓展应用于尿路感染患者尿液细菌的直接鉴定和快速药敏。
方法:
1.建立差速离心直接浓缩分离病原菌的方法，将膀胱癌患者尿液进行差速离心，分离浓缩病原菌，评估所建立方法的分离效果。
2.将所分离浓缩的膀胱癌患者细菌沉淀物进行MALDI-TOFMS直接鉴定。
3.利用尿液流式UF-1000i技术筛查尿路感染患者，确定尿液病原菌浓度的cut-off值。
4.将所分离浓缩的病原菌沉淀物进行MALDI-TOFMS直接鉴定和VITEK2快速药敏，评估直接鉴定和快速药敏与常规尿液培养方法的符合率，及该方法的周转时间(Turn-around Time，TAT)。
结果:
1.所建立的差速离心方法对革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌都取得较好的分离浓缩效果，细胞及其碎片被有效去除。
2.MALDI-TOFMS对膀胱癌与正常对照浓缩分离后的细菌沉淀物可获得部分蛋白峰，但基于现有的细菌质谱数据库，不能够得到有效分析，未能直接鉴定出不可培养细菌。
3.通过对1638个尿液样本进行UF-1000i筛选，确定尿液病原菌浓度cut-off值为≥5000细菌/μl。在1638个尿液样本中，病原菌浓度≥5000细菌/μl的尿液样本有307个，其中265个(86.32％)为单菌生长，适合下一步进行MS直接鉴定，16个为双菌生长，22个培养为污染，4个培养阴性;＜5000细菌/μl的尿液样本有1331个，其中98个单菌生长，6个双菌生长，即总体漏检率为6.35％(104/1638)。
4.利用本MALDI-TOFMS直接鉴定方法对184例革兰阴性杆菌感染的尿液样本进行了直接鉴定，有163例(88.59％)的质谱鉴定得分高于2，17例(9.24％)的得分为1.7-2，而得分低于1.7仅有4例(2.17％)。在163例鉴定到种的革兰氏阴性杆菌中，大肠埃希菌的鉴定符合率为98.01％(99/101)，肺炎克雷伯菌为97.22％(35/36)，其余例如变形杆菌、铜绿假单胞菌等符合率均为100％。在15个葡萄球菌感染尿液样本中，有14个(93.33％)获得了可靠直接鉴定，而在51个肠球菌属样本中，只有32个(62.75％)被可靠鉴定。在9个念珠菌样品中，仅2个在属水平上被直接鉴定，效果较差。
5.对72例肠杆菌目尿液样本一共做了1296项药敏测试，两种方法之间的整体类别一致率为94.83％(11229/1296)，小错误率为4.17％(54/1296)，大错误率为0.92％(12/1296)，极大错误率为0.08％(1/1296)。在18例革兰氏阴性非发酵菌的样品中，共进行了378次药敏测试，整体类别一致率为94.44％(357/378)，小错误率为2.91％(11/378)，大错误率为1.59％(6/378)，极大错误率为1.06％(4/378)。在10例葡萄球菌的样品中共进行了160次药敏测试，总体类别一致率为94.38％(151/160),小错误率为3.12％(5/160)，大错误率为1.87％(3/160)，极大错误率为0.63％(1/160)。
6.利用所建立的尿液流式-质谱-VITEK方法进行直接鉴定和快速药敏的TAT时间缩短至6-24h。
结论:
1.所建立差速离心法可以浓缩分离尿液细菌，对膀胱癌与正常对照尿液细菌沉淀物进行质谱分析可获得蛋白峰，但基于现有细菌质谱数据库的鉴定效果较差，未能直接鉴定出不可培养细菌。
2.该方法能够用于尿路感染患者细菌的质谱直接鉴定和VITEK系统快速药敏，整体一致率较高。
3.所建立的尿液流式-质谱-VITEK方法对革兰阴性杆菌直接鉴定和快速药敏的TAT时间缩短至6-24h。