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研究背景
神经管缺陷(neural tube defects，NTDs)是一种严重的先天性脑发育缺陷，它们是由于胚胎时期神经管发育过程中的闭合异常引起，主要表现为脑的缺失、脑的扩张、脑膜的扩张和隐性脊柱裂。神经干细胞(neuralstem cells，NSCs)参与神经管闭合，它的增殖、分化和迁移是神经管正常闭合的关键，NSCs的分化异常导致脑发育异常。NSCs是神经系统中最不稳定的细胞，具有自我更新性和多能性，能分化产生三种基本的神经外胚层谱系。NSCs在其整个生命周期中以区域和阶段相适应的方式产生神经元(neuron)、星形胶质细胞(astrocyte)和少突胶质细胞(oligodendrocyte)。
在各种细胞命运调控通路中，Notch信号通路在细胞增殖、分化及胚胎发育中起着精密而复杂的调控作用。Notch信号通路是进化上高度保守的通路，它在多细胞动物及人类的多种细胞分化过程中发挥作用。脊椎动物Notch信号通路是由Notch受体[Notch1(N1)-Notch4]，Notch配体(DSL，Delta1-Delta4)和锯齿状配体(Jagged1-Jagged2)以及DNA结合蛋白RBPjk/CBF1组成。Notch受体的胞外端与配体结合激活后，会产生两个连续的蛋白水解过程，第一是胞外域S2切割位点[1]，第二是发生在膜内S3的切割位点，随后Notch胞内段(intracellular domain of Notch，NICD)被释放进入细胞核，随后与DNA结合蛋白形成复合物，该复合物进一步调控下游靶基因从而调控细胞增殖分化。研究表明，γ-内分泌酶是参与Notch受体在S3切割位点关键，而早老素1(presenilin 1，PS1)是γ-内分泌酶复合体的催化活性中心[2]。
全反式维甲酸(all-trans Retinoic Acid, atRA)是维甲酸在人体内的正常代谢产物，是胚胎发育的重要因素。研究发现，atRA过量会导致NTDs的发生，但其具体的分子机制尚未得到明确的研究。本研究证实了Notch1在atRA处理小鼠胚胎脑组织(体内)和NSCs(体外)中的作用。此外，我们还首次证明了atRA通过抑制PS1从而降低Notch1信号通路活性，从而促进NSCs分化，进一步揭示了atRA引起NTDs的分子机制。该研究为神经干细胞的应用和出生缺陷的临床预防提供新的方向。
第一部分小鼠神经管缺陷模型的建立及Notch1在atRA诱导的神经管缺陷中的作用机制
研究目的
本部分旨在建立小鼠神经管缺陷模型，在模型基础上探讨Notch1在全反式维甲酸(atRA)诱导的神经管缺陷(NTDs)中的作用机制。
研究方法
将C57BL/6雌鼠随机分成实验组和对照组，实验组孕第7天给予100mg/kg的atRA灌胃，对照组孕第7天给予相同体积玉米油灌胃，孕鼠于孕11、13、15、17日处死后取胎鼠，对其大脑进行苏木精和伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色检测脑发育异常情况。通过免疫荧光和Westernblot检测小鼠胚胎脑内Notch1表达部位和表达量。
研究结果
atRA可诱导小鼠胚胎的脑发育异常。与对照组相比，暴露于atRA组的胚胎更早显示出对称的脑实质形成，且脑实质生长更加明显，可以诱导神经管畸形模型建立。Notch1存在于胚胎小鼠脑组织的神经上皮层，统计学分析结果提示atRA处理组的小鼠胚胎脑组织中Notch1表达明显低于对照组。
研究结论
atRA能够诱导建立小鼠胚胎的神经管缺陷模型，同时抑制胚胎脑组织神经上皮层Notch1的激活而促进神经管的分化，导致NTDs。
第二部分Notch1对atRA诱导的神经干细胞分化中的作用
研究目的
1.本部分旨在进行神经干细胞的分离和培养，鉴定神经干细胞及分化产生的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞，并检测Notch1在上述细胞中的分布。
2.用atRA处理神经干细胞，检测Notch1、PS1和神经干细胞分化产生的各种细胞标记物的表达，研究Notch1、PS1与atRA处理的神经干细胞分化中的分子机制。
研究方法
1.取孕18.5天胎鼠的大脑提取原代神经干细胞，用含有10％胎牛血清的分化培养基对神经干细胞进行诱导分化。
2.通过免疫荧光的方法鉴定Notch1与神经干细胞标记物-巢蛋白(Nestin)、神经元标记物-神经丝蛋白(neurofilament，NF)、星型胶质细胞标记物-胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)及少突胶质细胞标记物-半乳糖(基)神经酰胺酶(galactosylceramidase，GALC)在神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中的表达。
3.通过Westernblot方法检测atRA处理组和对照组NSCs中Notch1、PS1、NF、GFAP、GALC的含量在培养第1天(D1)，第3天(D3)，第5天(D5)和第7天(D7)表达的变化。
研究结果
1.原代神经干细胞培养显示神经细胞分化的整个过程。分化培养0天时，可见神经球附着与瓶底。培养1天时，神经球体积增大，可见少量NSCs从神经球中释放，开始复制分裂。培养3天时，不同类型的细胞出现在神经球周围，单个细胞伸出条索状突起。培养7天时，可检测到不同形状的细胞，包括神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
2.免疫荧光染色中细胞标志蛋白Nestin、NF、GFAP及GALC荧光成阳性，说明神经干细胞分化出神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。同时检测到神经干细胞及分化细胞中Notch1与Nestin、NF、GFAP及GALC共表达。
3.对照组中Notch1和PS1表达水平有规律的下降，但NF、GFAP和GALC的表达水平逐步升高，提示Notch1表达的降低在一定程度上显著促进了神经干细胞的分化。atRA处理组，Notch1和PS1的表达水平逐渐降低，而NF、GALC和GFAP的表达水平显著升高，提示atRA提高NSCs的分化能力，atRA处理NSCs后通过抑制PS1逐渐降低Notch1表达。
研究结论
1.NSCs及其分化的神经元细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞中存在Notch1的表达。
2.atRA处理神经干细胞后，通过抑制PS1降低Notch1信号通路活性促进神经干细胞分化。
神经管缺陷(neural tube defects，NTDs)是一种严重的先天性脑发育缺陷，它们是由于胚胎时期神经管发育过程中的闭合异常引起，主要表现为脑的缺失、脑的扩张、脑膜的扩张和隐性脊柱裂。神经干细胞(neuralstem cells，NSCs)参与神经管闭合，它的增殖、分化和迁移是神经管正常闭合的关键，NSCs的分化异常导致脑发育异常。NSCs是神经系统中最不稳定的细胞，具有自我更新性和多能性，能分化产生三种基本的神经外胚层谱系。NSCs在其整个生命周期中以区域和阶段相适应的方式产生神经元(neuron)、星形胶质细胞(astrocyte)和少突胶质细胞(oligodendrocyte)。
在各种细胞命运调控通路中，Notch信号通路在细胞增殖、分化及胚胎发育中起着精密而复杂的调控作用。Notch信号通路是进化上高度保守的通路，它在多细胞动物及人类的多种细胞分化过程中发挥作用。脊椎动物Notch信号通路是由Notch受体[Notch1(N1)-Notch4]，Notch配体(DSL，Delta1-Delta4)和锯齿状配体(Jagged1-Jagged2)以及DNA结合蛋白RBPjk/CBF1组成。Notch受体的胞外端与配体结合激活后，会产生两个连续的蛋白水解过程，第一是胞外域S2切割位点[1]，第二是发生在膜内S3的切割位点，随后Notch胞内段(intracellular domain of Notch，NICD)被释放进入细胞核，随后与DNA结合蛋白形成复合物，该复合物进一步调控下游靶基因从而调控细胞增殖分化。研究表明，γ-内分泌酶是参与Notch受体在S3切割位点关键，而早老素1(presenilin 1，PS1)是γ-内分泌酶复合体的催化活性中心[2]。
全反式维甲酸(all-trans Retinoic Acid, atRA)是维甲酸在人体内的正常代谢产物，是胚胎发育的重要因素。研究发现，atRA过量会导致NTDs的发生，但其具体的分子机制尚未得到明确的研究。本研究证实了Notch1在atRA处理小鼠胚胎脑组织(体内)和NSCs(体外)中的作用。此外，我们还首次证明了atRA通过抑制PS1从而降低Notch1信号通路活性，从而促进NSCs分化，进一步揭示了atRA引起NTDs的分子机制。该研究为神经干细胞的应用和出生缺陷的临床预防提供新的方向。
第一部分小鼠神经管缺陷模型的建立及Notch1在atRA诱导的神经管缺陷中的作用机制
研究目的
本部分旨在建立小鼠神经管缺陷模型，在模型基础上探讨Notch1在全反式维甲酸(atRA)诱导的神经管缺陷(NTDs)中的作用机制。
研究方法
将C57BL/6雌鼠随机分成实验组和对照组，实验组孕第7天给予100mg/kg的atRA灌胃，对照组孕第7天给予相同体积玉米油灌胃，孕鼠于孕11、13、15、17日处死后取胎鼠，对其大脑进行苏木精和伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色检测脑发育异常情况。通过免疫荧光和Westernblot检测小鼠胚胎脑内Notch1表达部位和表达量。
研究结果
atRA可诱导小鼠胚胎的脑发育异常。与对照组相比，暴露于atRA组的胚胎更早显示出对称的脑实质形成，且脑实质生长更加明显，可以诱导神经管畸形模型建立。Notch1存在于胚胎小鼠脑组织的神经上皮层，统计学分析结果提示atRA处理组的小鼠胚胎脑组织中Notch1表达明显低于对照组。
研究结论
atRA能够诱导建立小鼠胚胎的神经管缺陷模型，同时抑制胚胎脑组织神经上皮层Notch1的激活而促进神经管的分化，导致NTDs。
第二部分Notch1对atRA诱导的神经干细胞分化中的作用
研究目的
1.本部分旨在进行神经干细胞的分离和培养，鉴定神经干细胞及分化产生的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞，并检测Notch1在上述细胞中的分布。
2.用atRA处理神经干细胞，检测Notch1、PS1和神经干细胞分化产生的各种细胞标记物的表达，研究Notch1、PS1与atRA处理的神经干细胞分化中的分子机制。
研究方法
1.取孕18.5天胎鼠的大脑提取原代神经干细胞，用含有10％胎牛血清的分化培养基对神经干细胞进行诱导分化。
2.通过免疫荧光的方法鉴定Notch1与神经干细胞标记物-巢蛋白(Nestin)、神经元标记物-神经丝蛋白(neurofilament，NF)、星型胶质细胞标记物-胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)及少突胶质细胞标记物-半乳糖(基)神经酰胺酶(galactosylceramidase，GALC)在神经干细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中的表达。
3.通过Westernblot方法检测atRA处理组和对照组NSCs中Notch1、PS1、NF、GFAP、GALC的含量在培养第1天(D1)，第3天(D3)，第5天(D5)和第7天(D7)表达的变化。
研究结果
1.原代神经干细胞培养显示神经细胞分化的整个过程。分化培养0天时，可见神经球附着与瓶底。培养1天时，神经球体积增大，可见少量NSCs从神经球中释放，开始复制分裂。培养3天时，不同类型的细胞出现在神经球周围，单个细胞伸出条索状突起。培养7天时，可检测到不同形状的细胞，包括神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
2.免疫荧光染色中细胞标志蛋白Nestin、NF、GFAP及GALC荧光成阳性，说明神经干细胞分化出神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。同时检测到神经干细胞及分化细胞中Notch1与Nestin、NF、GFAP及GALC共表达。
3.对照组中Notch1和PS1表达水平有规律的下降，但NF、GFAP和GALC的表达水平逐步升高，提示Notch1表达的降低在一定程度上显著促进了神经干细胞的分化。atRA处理组，Notch1和PS1的表达水平逐渐降低，而NF、GALC和GFAP的表达水平显著升高，提示atRA提高NSCs的分化能力，atRA处理NSCs后通过抑制PS1逐渐降低Notch1表达。
研究结论
1.NSCs及其分化的神经元细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞中存在Notch1的表达。
2.atRA处理神经干细胞后，通过抑制PS1降低Notch1信号通路活性促进神经干细胞分化。