论文部分内容阅读
目的:纳米银是一种基于纳米技术的新型抗菌材料,具有很高的抗菌性和耐药性,是其他抗菌药物无法比拟的。纳米银的生物合成有着成本低,安全无污染等特点,在纳米银的合成领域有着良好的发展前景。本文通过生物合成的方法研究石榴皮鞣质-纳米银复合物(PPT-AgNPs)的最佳制备工艺、探讨生物合成的PPT-AgNPs对临床常见微生物的抗菌活性及对金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli)的抑菌机理。为后续开发以中药为还原剂的生物合成纳米银法提供指导意义,也为纳米银进一步的抑菌应用提供理论依据。方法:1)本实验创新性得利用石榴皮鞣质提取液(PPT)作为还原剂、分散剂,以PPT-AgNPs的吸光度为参考依据,考察PPT的加入量、硝酸银(AgNO3)溶液浓度、合成温度及合成时间等因素对PT-AgNPs颗粒形成的影响,并筛选出最优合成的工艺。并用扫描电镜、透射电镜、X射线粉末衍射仪等手段对绿色合成的纳米银进行表征。2)采用试管二倍稀释法测定PPT-AgNPs对多种常见临床病原菌的抗菌活性,并选取敏感性较高的革兰氏阳性菌-S.aureus和革兰氏阴性菌-E.Coli为供试菌,通过紫外吸光度测定PPT-AgNPs与细菌作用前后的生长曲线;通过透射电镜和扫描电镜观察细菌给药前后的超微结构变化,通过相应试剂盒测定给药前后细菌胞体内外的AKP、K+、蛋白质核酸的含量及呼吸链脱氢酶的活性变化。通过RT-PCR实验测定给药前后菌体内修复相关基因recA和recN的表达量,初步阐明了PPT-AgNPs对细菌的抑菌机理。结果:1)PPT-AgNPs制备的最优条件:PPT(1 g/L)与2 mmol/L硝酸银溶液体积比为1∶4,25℃反应4 h,所得复合物性能稳定,重现性好,大部分形状为球形,平均粒径约为42 nm。2)PPT-AgNPs对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有高效抗菌活性。当然PPT-AgNPs对不同菌种的MIC也略有差别。其中对E.Coli和S.aureus效果最为明显。PPT-AgNPs对革兰氏阴性菌E.Coli的MIC为0.625mg/ml,MBC为0.625mg/ml。对革兰氏阳性菌S.aureus的MIC为0.625mg/ml,MBC为1.25mg/ml。生长曲线实验表明与正常细菌的S型生长周期不同,在细菌生长的前三个小时,给药组的生长曲线已受到明显的抑制作用。并且随着给药浓度的增加,细菌可能直接被杀死,导致生长曲线一直无增长趋势。同时,与对照组相比,细胞外AKP,K+和核酸含量显着增加。胞内呼吸链脱氢酶含量显著降低,且均与药物浓度呈正相关。这些变化表明PPT-AgNPs作用后,细胞膜、细胞壁的通透性增加;蛋白质核酸表达受到抑制;呼吸链脱氢酶失活。透射电镜和扫描电镜观察到菌体的细胞完整性被破坏,促使细胞畸形形变,无法正常生长。RT-PCR实验结果显示,PPT-AgNPs处理后修复系统相关基因recA和recN基因的表达量增加,随后又降低。说明PPT-AgNPs可能破坏了DNA的结构,迫使机体内短时间内紧急启动了SOS修复。然而随着药物作用时间的延长,SOS修复系统不再起作用,recA和recN基因的表达量重新降低,此时细菌可能发生突变甚至死亡。结论:本论文探讨了纳米银合成的生物方法,报道了采用PPT合成纳米银的方法。本制备方法绿色、稳定、可行。PPT-AgNPs对临床常见致病菌具有广谱抗菌作用,通过研究PPT-AgNPs的抑菌机理,推测PPT-AgNPs加入菌液后释放出Ag+,Ag+可以与膜蛋白结合,导致细胞膜渗透性发生变化。无机离子和小分子物质竞相渗出,使胞内外质子势差逐渐消失,导致胞内ATP耗竭。同时Ag+还可以竞争性的吸附酶或蛋白质上的巯基(SH),导致多种酶和蛋白质活性的降低或丧失。此外Ag+还可以使膜蛋白上的电子传递与氧化磷酸化通路脱偶联,限制呼吸链酶,导致呼吸链脱氢酶失活。同时,Ag+在与核酸络合时,会优先与核苷相互作用,嵌入嘌呤-嘧啶之间的碱基对中,从而破坏DNA的结构,导致细胞的死亡。