【摘 要】
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葡聚糖蔗糖酶因为能够以低廉的蔗糖为底物,合成各种特异的低聚糖或糖基化产物,在食品、饲料、医药、美容等工业领域有着广泛的用途,逐渐发展为生物催化合成中一种重要的工具
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葡聚糖蔗糖酶因为能够以低廉的蔗糖为底物,合成各种特异的低聚糖或糖基化产物,在食品、饲料、医药、美容等工业领域有着广泛的用途,逐渐发展为生物催化合成中一种重要的工具酶。葡聚糖蔗糖酶产物的特异性与酶的特异性和反应条件等相关。来源于口腔变形链球菌(Streptococcus mutans)GS5的(JTF-D天然供体底物是蔗糖,对其它二糖不会发生作用,本实验对该酶进行蛋白质定向进化,以期获得能够以乳糖为糖供体,发生转糖基反应的突变子。实验结果如下：1、对该酶受体结合区4个氨基酸位点(Arg463、His583、Asp584、Gln965)进行定点饱和突变,并转化大肠杆菌MC1061,建立了一个可高效表达的突变体文库(GTF-SM3);2、利用GTF-D的转糖基特异性引入了一个可以检测到特异性转糖基反应的报告基因载体,共同转入表达宿主BW251131acZ-ebgA-中反应,建立了一个能够用GLACK平板进行高通量筛选的方法,具体为突变酶能将乳糖转化生成异乳糖,诱导lac启动子的开启和其后报告基因的表达,表现出Km抗性,能在平板上被检测到；3、实验发现了大肠杆菌中另一个半乳糖苷酶EbgA有lacZ的功能替代作用,在本实验条件下,EbgA有很高的概率发生具有p-半乳糖苷酶活性的突变(5/9),当敲除基因ebgA时,突变体假阳性消失；4、在经过多次筛库后,实验成功筛选到一株突变体SN3-b用色谱法分析,它能在无半乳糖苷酶的宿主菌中表现出明显的水解乳糖活性。
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