论文部分内容阅读
白芍与赤芍,是我国传统的中药材,已有数千年的使用历史。根据《中国人民共和国药典》(第一部)2010年版(下称中国药典)规定,赤芍(Paeoniae Radix Rubra)为毛莨科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)或川赤芍(Paeonia veitchii Lynch.)直接使用的干燥根;白芍(Paeoniae Radix Alba)为植物芍药(Paeonia lactifloraPall.)水煮去皮后使用的干燥根。过往已有研究指出,白芍、赤芍所含化学成分类似,但含量比例不同。现时并未有系统性的研究,针对二芍的化学成分与其生物活性的异同作分析比较,而两者在药效方面,传统中医药理论只对二芍作出简短的描述「白补而赤泻,白收而赤散」,使其在临床上分开使用。可是,历版《中国药典》中规定芍药苷是区分同一物种来源的赤芍和白芍药材的唯一定量指标。芍药苷的含量在赤芍中不得低于1.8%,在白芍中不得少于1.6%。这种对单一成分的检测显然缺乏专属,难以有效区分白芍与赤芍。实验尝试通过白芍、赤芍化学成分的研究,了解二芍所含的化学成分及其比例,同时利用白芍、赤芍及其单体化合物进行一系列体外细胞的生物活性研究,从化学成分和细胞生物效应层而来合理阐释二芍的异同,不仅可以为白芍、赤芍在中医临床上分用提供更科学的参考依据,更可完善中国药典对白芍、赤芍的理化鉴别提供更合适的定量指标,为区分白芍与赤芍有特别重要的现实意义。目的:1.对赤芍、白芍中所含的目标化学成分进行定量分析。2.利用白芍、赤芍水提液及其单体化合物对巨噬细胞J774进行细胞活力、增殖、调亡及抗炎模型的研究。3.对白芍、赤芍的生物活性及其活性成分进行系统性评价。方法:1.赤芍和白芍原药材粗碎,去离子水加热回流提取2次,过滤并合并滤液:减压旋转蒸发浓缩,制成1mg/ml(?)的白芍及赤芍水提液,利用HPLC法同时测定了赤芍和白芍样品中化学成分的含量,Waters symmetry C18(4.6×250mm,5μm);流动相:A为0).1%磷酸水溶液(pH2.7),β3为乙腈(v/v):梯度洗脱,流速:0.8mL·min-1;检测波长:入=230nm和270nm;柱温:30℃。对白芍、赤芍进行化学定量评价。2.采用体外培养小鼠巨噬细胞J774,加入不同剂量的白芍、赤芍水提液及其单体化合物,通过MTT比色法检测各药物对J774细胞活力的影响。3.采用体外培养小鼠巨噬细胞J774,加入不同剂量的白芍、赤芍水提液及其单体化合物进行生长周期及凋亡实验,利用PI及Annexin V-FITC染色法,通过流式细胞仪检测各药物对细胞的生长周期及凋亡的影响。4.利用LPS诱导巨噬细胞J774模型,加入不同剂量的白芍、赤芍水提液及其单体化合物进行抗炎实验,利用Griess试剂检测各药物对细胞一氧化氮生成的影响。结果:1.通过HPLC对目标化合物的定量检测,白芍和赤芍水提液所含的单体化合物组成及含量均有差异。2.利用体外培养小鼠巨噬细胞J774,以1mg/ml白芍和赤芍水提液及其单体化合物对细胞进行细胞活力实验,通过MTT比色法,于48h,白芍增强(P<.01),而赤芍减低(P<.001)细胞活力;苯甲酰芍药苷和芍药内酯苷增强(P<.001),而没食子酸和1,2,3,4,5-五没食子酰基葡萄糖减低(P<.001)细胞活力。3.利用流式细胞检测仪,以1mg/ml白芍和赤芍及其单体化合物对J774细胞进行生长周期及凋亡实验,通过PI及Annexin V-FITC染色法,于48h,白芍促进(P<.05),而赤芍抑制(P<.001)细胞生长周期;芍药苷亚硫酸酯、苯甲酰芍药苷及芍药内酯苷能促进(P<.01),而没食子酸则抑制(P<.001)细胞生长周期。于24h,二芍同时增加(P<.01-001)细胞的早期凋亡,赤芍及没食子酸的凋亡强度明显较白芍高。4.通过LPS诱导巨噬细胞J774模型,以不同浓度的白芍和赤芍水提液及其单体化合物对细胞一氧化氮生成的影响,于24h利用Griess试剂检测,当白芍和赤芍浓度达0.1mg/ml或以上,两者均能有效抑制细胞成一氧化氮(P>.05);而单体方面,除苯甲酰芍药苷外,所有单体均能抑制J774细胞一氧化氮的生成(P>.05)。结论:本研究通过化学定量分析及体外进行小鼠巨噬细胞J774的生物活性实验,有系统地对白芍、赤芍中药材化学成分、生物效应及其活性成分差异进行分析,通过两者比较,发现白芍和赤芍对生物效应有所偏重,并为二芍和传统中医药学理论分开使用提供客观依据。研究数据能够为优化临床用药和中药材的质量控制做了有意义的探