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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus),是一无囊膜的单股环状负链DNA病毒。PCV2与其他病原体混合感染猪只,对我国猪业养殖威胁巨大,疫苗免疫是防控PCV2的常规方法。市面上PCV2疫苗主要为灭活疫苗,该类疫苗对PCV2的防控起到了重要作用。但此类疫苗存在一定缺陷,例如无法诱导宿主产生细胞免疫,所产生的抗体无法野毒与抗体相区分,且价格颇高。因此研究安全、高效、廉价,通过相应配套的ELISA试剂盒能快速区分所产生的抗体为疫苗或野毒感染的亚单位疫苗意义重大。大肠杆菌源表达系统作为原核蛋白表达系统中最为成熟的表达系统代表,因其具有遗传背景单一、宿主菌增殖迅速、诱导手段简洁、蛋白表达量高、成本低廉等优点,在基因工程研究中被广泛选用。本研究拟应用原核表达系统对带有V5标签的PCV2 Cap蛋白进行表达。采用基因工程技术,将V5表位标签引入PCV2 ORF2基因的末端,并构建相应的原核表达载体。1、携带标记的pET32a(+)-PCV2-ORF2m-V5重组质粒的构建本研究首先应用在线软件对PCV2 GZ-RH1株的ORF2与大肠杆菌的密码子进行了比对分析。结果表明,PCV2 GZ-RH1株的ORF2在选择大肠杆菌表达系统进行外源表达时,稀有密码子出现频率较高,需进行密码子优化以提高表达效率。据此,人工合成了两端携带不同酶切位点,并在3’端引入了V5标签和更换部分稀有密码子的PCV2-ORF2m-V5 DNA片段。该合成基因经T克隆后,用酶切、质粒PCR和测序鉴定。提取pMD19-T-PCV2-ORF2m-V5质粒,经酶切后纯化回收PCV2-ORF2m-V5 DNA片段,将其亚克隆至pET32a(+)原核表达载体中,成功构建了pET32a(+)-PCV2-ORF2m-V5重组原核表达质粒。2、携带分子标记的PCV2 Cap-V5蛋白的原核表达实验将构建的pET32a(+)-PCV2-ORF2m-V5质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,利用Amp筛选转化后的阳性菌落并增菌培养,以1 mmol/L IPTG作为诱导剂,分别在37℃和16℃条件下,诱导菌液表达3 h。分别取未经IPTG诱导的转化菌和经诱导的转化菌进行处理后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Western-blotting)鉴定分析,结果显示重组标记蛋白质大小与预期结果相符,约为47.6 kDa,且主要以包涵体形式表达;使用His、V5单克隆抗体均能与Cap-V5蛋白结合,且反应原性良好;在其他条件相同的情况下,37℃诱导Cap-V5蛋白表达量高于16℃。本研究可为PCV2亚单位标记疫苗的前期研究和区分疫苗抗体与野毒抗体的ELISA方法建立奠定实验基础。