研究背景结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是消化道常见的恶性肿瘤之一。2020年CRC成为全球第三大最常见的恶性肿瘤,同时高居全球癌症死亡因素的第二位。目前CRC的治疗方法以手术联合辅助放化疗为主,但患者常出现严重的放化疗毒副反应、耐药性和疾病转移复发,导致预后不良,并且疾病的复杂性和高耐药率导致CRC的治疗难度增加。饮食是影响CRC最重要的外源性因素之一,约70%-90%的CRC与饮食因素有关。流行病学和基础研究均发现,日常膳食中的生物活性成分具有降低CRC发生风险的潜力,与传统的化疗药物相比具有多靶点,多途径,副作用较小等优势,是肿瘤防治的一个重要选择方向。从膳食中寻找低毒副作用,且效果良好的抗肿瘤物质,是目前肿瘤防治,尤其是消化道肿瘤防治的重要方向与策略。秋葵花为秋葵的副产品,产量丰富,仅少部分被作为保健茶食用,其余大多被丢弃。秋葵花富含多糖和黄酮两类重要的生物活性成分,含量远高于其他大多数花类,具有抗氧化、抗炎、免疫调节等多种生物学活性,在维护肠道健康及CRC防治方面有较大优势和潜能。但目前对秋葵花生物活性的研究报道较少,关于其抗肿瘤活性的研究更是缺乏,因此本研究探讨了秋葵花中黄酮和多糖活性成分的抗CRC活性及其可能作用靶点和潜在机制。研究目的（1）细胞观察和增殖活性实验初步评价秋葵花黄酮和多糖提取物的体外抗CRC细胞增殖能力,体外抗氧化活性实验评价提取物的抗氧化活性。（2）通过CT26荷瘤小鼠模型检测秋葵花黄酮纯化提取物（Abelmoschus esculentus（Linn.）Moench flower flavonoids extract,AFE）对CRC肿瘤生长的抑制作用。（3）从细胞凋亡、衰老、自噬和转移方面,探索AFE在体外细胞水平对CRC细胞的抑制作用及机制。（4）通过致癌剂氧化偶氮甲烷（Azoxymethane,AOM）和致炎剂葡聚糖硫酸钠（Dextran sulfate sodium salt,DSS）协同诱导的炎症相关CRC小鼠模型,探究秋葵花中黄酮纯化提取物AFE及秋葵花粗多糖提取物（Abelmoschus esculentus（Linn.）Moench flower polysaccharides extract,APE）的抗CRC效应,并探索两者在CRC发生发展过程中的作用潜力及潜在的作用机制。研究方法（1）乙醇提取法提取秋葵花中的黄酮类物质,获得秋葵花乙醇提取物AE,其后用大孔树脂AB-8对AE进行纯化除杂,获得秋葵花黄酮纯化产物为AFE。（2）通过热水浸提、乙醇沉淀提取秋葵花乙醇提取残渣中的多糖,获得秋葵花粗多糖APE。（3）体外细胞增殖活性实验和抗氧化活性实验检测秋葵花提取物AE、AFE和APE的体外抗CRC细胞增殖的活性和抗氧化活性。（4）基于UPLC-QTOF-MS技术分析AFE中主要的黄酮类化合物。（5）CT26荷瘤小鼠模型检测AFE在体内抑制CRC肿瘤生长的作用,通过肿瘤的生长曲线、质量、HE染色及免疫组化Ki67染色评价AFE抑制CRC生长的作用效果,并通过脏器指数、脏器病理染色和生化指标评价AFE在体内的安全性。（6）AFE抑制CRC细胞增殖和转移的分子机制探索:细胞生长曲线和克隆形成实验检测AFE对CRC细胞生长的影响,流式细胞术和荧光染色检测AFE对细胞线粒体结构和功能的影响;Western Blot、流式细胞术、荧光染色等实验技术,检测AFE对凋亡、衰老、自噬途径的影响及作用机制;细胞划痕和Transwell迁移侵袭实验检测AFE对细胞转移能力的影响,并通过Western Blot进行相关机制探索。（7）AOM/DSS诱导建立结肠炎相关CRC小鼠模型:采用腹腔注射AOM,7天后饮用水换为DSS饮用水,维持7天后恢复正常饮用水14天,此为一个DSS循环,总共循环3次。于腹腔注射前一周起灌胃干预AFE和APE持续至实验结束时,收集结肠、小肠、肝、脾、肺、肾、胸腺等组织。（8）通过观察指标:肛门垂落比率、体重降低程度、疾病活动指数评分、结肠长度、结肠肿瘤数目、脏器指数,初步评价AFE及APE对CRC癌变的预防作用效果。（9）通过小肠、结肠的HE病理染色,以及炎症和紧密连接蛋白的免疫组化染色评价AFE及APE对AOM/DSS诱导的小鼠结肠炎症和结构的影响。（10）Western Blot检测AFE及APE对CAC发展过程中炎症相关信号通路及CRC发生发展关键信号通路的影响。（11）AOM/DSS诱导炎症相关CRC模型实验结束前收集实验小鼠粪便,通过16r RNA测序技术,从肠道菌群角度,探索AFE及APE对小鼠肠道菌群的作用及影响。结果（1）秋葵花醇提物AE及纯化产物AFE都是具有良好的抗CRC细胞增殖活性的天然抗氧化剂。与秋葵花醇提物相比,经过大孔树脂纯化后,AFE的抗氧化活性及抗CRC细胞增殖能力显著提升。AFE中主要包含了14种黄酮类化合物,其中大多以糖苷形式存在。（2）秋葵花粗多糖APE在体外抑制CRC细胞增殖的能力较弱,且APE在体外清除DPPH和ABTS自由基的能力较低。（3）AFE具有良好的抗CRC活性作用,能在体外抑制CRC细胞的活性和增殖,在体内能有效抑制CT26荷瘤小鼠肿瘤的生长,且表现出较好的安全性。与作为治疗剂相比较,AFE作为预防剂时对肿瘤生长的抑制作用更明显。（4）AFE通过降低线粒体膜电位、活性氧水平,升高胞内钙离子浓度,诱导CRC细胞线粒体功能障碍,而对正常结肠上皮细胞不造成影响和损伤。进一步的机制研究发现,AFE抑制CRC细胞增殖,可能是通过激活P53:诱导Bcl2家族中凋亡相关分子的改变,导致CRC细胞中细胞色素c的释放以及Caspase3的活化,引起内源性凋亡;激活P53/P21/P16/c-Myc介导的细胞衰老途径;促进CRC细胞自噬的早期阶段,并抑制自噬晚期阶段。此外,AFE通过调节MMP2/TIMP2间的平衡,抑制MMP9和增加E-cadherin的表达水平,从而抑制上皮间质转化,降低CRC细胞的迁移和侵袭。（5）AFE和APE能够抑制AOM/DSS诱导导致的直肠脱垂和疾病活动指数增加、提高小鼠存活率、缓解体重减轻和结肠长度缩短、减少结肠组织肿瘤数目,发挥抗CRC的活性作用,有效抑制了小鼠原位CRC的发生、发展。并且AFE和APE能够抑制由AOM/DSS诱导所致的肝、脾、胸腺的肿大。（6）AFE和APE能够显著改善CAC小鼠肠道的病理状况,缓解由AOM/DSS诱导导致的结肠和小肠的隐窝及结构的损伤和炎症程度,通过增加结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和闭合蛋白Occludin的表达恢复肠道屏障的完整性,并通过减少结肠组织中COX-2和EMR1的表达减轻小鼠结肠的炎症程度。（7）Western Blot实验表明,AFE通过抑制MAPK、JAK/Stat3和NFκB/IL-6/Stat3炎症相关信号通路降低CAC小鼠中IL-6等促炎介质水平,以及调节PI3K/AKT和Wnt信号传导路径,抑制结肠炎驱动的CRC。此外,体外细胞实验也证实,AFE通过调节PI3K/AKT/m TOR,MAPK、Wnt、NFκB/IL-6/Stat3途径抑制小鼠CT26细胞的生长,与体内抗CRC机制相似。（8）APE可通过上调P38/MAPK的表达,诱导Nrf2活化,降低CAC小鼠中IL-6等促炎介质水平,通过调控PI3K/AKT,ERK/MAPK和Wnt信号转导途径,抑制结肠炎驱动的CRC。（9）AFE和APE能够逆转由AOM/DSS诱导引起的小鼠肠道菌群群落的改变,并增加肠道菌群的丰度和物种的多样性。在门水平中,AFE能够逆转AOM/DSS造模引起的厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度降低,以及拟杆菌门（Bacteroidota）和变形杆菌门（Proteobacteria）的相对丰度增加。在属水平中,AFE和APE可抑制由AOM/DSS诱导导致的拟杆菌属（Bacteroides）、副拟杆菌属（Parabacteroides）、副沙门氏菌（Parasutterella）、气味杆菌属（Odoribacter）、链球菌属（Streptococcus）相对丰度增加。与AOM/DSS模型对照组相比较,AFE干预能够有效增加毛螺菌科NK4A136属（LachnospiraceaeNK4A136group）和有益菌颤杆菌属（Oscillibacter）及拟普雷沃菌属（Alloprevotella）相对丰度;APE干预能够显著增加有益菌:拟普雷沃菌属（Alloprevotella）和普雷沃菌属（Prevotella）的相对丰度。结论（1）AFE在体内外均具有良好的抗CRC活性:在体外能够直接抑制CRC细胞的增殖生长及转移能力,在体内能够抑制CT26荷瘤小鼠肿瘤的生长及炎症相关CRC小鼠结肠肿瘤的形成。（2）APE在体外不能有效抑制CRC细胞增殖,在体内能够通过调节结肠信号通路活性和肠道菌群组成抑制炎症相关CRC小鼠结肠肿瘤的形成。（3）基于AFE及APE具有较安全、多靶点的特点,秋葵花中黄酮和多糖生物活性成分在防治CRC方面可能具有较大的应用潜力,可为秋葵花的深度开发和利用,以及完善和补充防治CRC的饮食建议提供科学依据。