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目的:慢性炎症反应释放氧化介质和各种细胞因子,在恶性肿瘤发生中起重要作用。本实验室前期研究发现长期灌胃黄曲霉毒素G1(AFG1)诱导的慢性炎症反应在肺腺癌发生中起重要作用。慢性炎症反应可以造成肿瘤来源的靶细胞II型肺泡上皮细胞(AT-II)氧化应激损伤和增殖,在这个过程中我们发现炎症细胞因子TNF-α和IL-6在炎症肺组织中高表达。IL-6是目前发现的具有癌基因功能的炎症细胞因子,但在AFG1诱导的炎症微环境中,IL-6是否加剧AFG1致AT-II细胞损伤作用还不清楚。为了揭示在AFG1诱导的炎症微环境中IL-6对AT-II细胞氧化应激损伤的影响,本研究体外培养具有人AT-II细胞特征的A549细胞,给予IL-6和AFG1共同作用,模拟IL-6和AFG1协同作用的慢性炎症微环境。探讨AFG1和IL-6联合作用对AFG1活化相关酶细胞色素P450(Cyp450)活性,以及A549细胞损伤的影响。方法:1细胞培养与处理具有人AT-II细胞特征的A549细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的RPMI-1640培养基中,37℃、5%CO2培养,细胞贴壁生长。选择对数生长期的细胞(传代后24 h)随机分为溶剂对照组和实验组。实验组给予AFG1(4μg/ml)单独处理和AFG1(4μg/ml)与IL-6(20μg/ml)联合处理,溶剂对照组给予终浓度为0.08%的DMSO(每组设平行样本3个),继续培养24 h收集细胞进行相关指标检测。2流式细胞术(FCM)采用流式细胞术(FCM)分别检测AFG1单独处理和AFG1与IL-6联合处理对A549细胞中活性氧生成的影响。3免疫组织化学(IHC)染色按照我研究组前期灌胃AFG1诱导NIH小鼠肺腺癌的动物造模方法,经口给予Balb/c小鼠灌胃AFG1 6个月(每周3次),停止灌胃AFG1。选择AFG1灌胃6个月的小鼠慢性炎症肺组织标本,检测肺泡上皮细胞中与毒素代谢相关活化酶细胞色素P450亚型,Cyp1A2、Cyp2A6和Cyp2A13的表达情况。4蛋白免疫印记(Western blot)采用蛋白免疫印记(Western blot)方法分别检测AFG1单独处理和AFG1与IL-6联合处理对A549细胞的影响,检测氧化应激损伤相关蛋白SOD2、γH2AX、ATM和ATR的表达;检测细胞色素酶P450亚型,Cyp1A2、Cyp2A6和Cyp2A13的表达情况;检测STAT3信号通路的激活,包括stat3和p-Stat3的蛋白表达;检测与增殖和凋亡相关蛋白BCL-XL、Cyclin D1、Bax等的表达情况。5 Real-time PCR采用Real-time PCR方法分别检测AFG1单独处理和AFG1与IL-6联合处理对炎症细胞因子分泌及A549细胞中Cyp450酶活性的影响,包括IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α、Cyp1A2、Cyp2A6、Cyp2A13和Cyp3A4。6 MTT采用MTT法检测AFG1单独处理和AFG1与IL-6联合作用对于A549细胞存活率的影响。7阻断剂处理对数生长期A549细胞,分别给予1μM Cpd188(STAT3的阻断剂)预处理30min。实验分为4组,即溶剂对照组、AFG1与IL-6联合处理组、阻断剂组、和阻断剂+AFG1+IL-6处理组。细胞处理24 h后收集细胞检测相关指标。8 si RNA转染用100 pmol STAT3特异性si RNA转染细胞,再加入AFG1+IL-6继续培养24 h收集细胞进行相关指标检测。同时转染Negative control si RNA(NC si RNA)作为阴性对照。检测STAT3基因被干扰后,蛋白的表达情况,包括Stat3、p-Stat3、Cyp1A2、Cyp2A6、Cyp2A13和γH2AX。9统计学分析应用SPSS Statistics17.0软件,计量资料以均数±标准差(sx±)表示,P<0.05时认为差异有统计学意义。结果:1 AFG1和IL-6联合处理对A549细胞氧化应激反应和DNA损伤的影响FCM和Western Blot实验结果表明,与AFG1单独处理组相比,IL-6和AFG1联合处理可以更早的引起A549细胞中ROS生成增多(P<0.05);AFG1单独处理对SOD-2表达没有影响,而IL-6和AFG1联合处理明显促进γH2AX和SOD-2的表达(P<0.05);DNA损伤的感应分子ATM和ATR在联合处理组也明显高于AFG1单独处理组(P<0.05)。说明IL-6与AFG1联合处理可以加速A549细胞中ROS生成,IL-6促进AFG1诱导的氧化应激损伤。2 IL-6和AFG1联合处理对A549细胞中细胞因子表达的影响Real-time PCR检测结果表明,与对照组相比,AFG1单独作用可以增加A549细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12和MIP-2的m RNA水平表达(P<0.05);IL-6与AFG1联合作用,进一步上调IL-1、IL-6、IL-10、IL-12的m RNA表达水平(P<0.05)。提示IL-6与AFG1发挥协同作用,促进AT-II细胞分泌炎症细胞因子。3灌胃AFG1肺部组织中Cyp450酶的表达情况选择AFG1灌胃6个月的小鼠慢性炎症肺组织标本,检测肺泡上皮细胞中与毒素代谢相关活化酶细胞色素P450亚型,Cyp1A2、Cyp2A6和Cyp2A13的表达情况。IHC染色结果显示,Cyp1A2、Cyp2A6和Cyp2A13的表达水平较对照组明显升高(P<0.05)。4 IL-6和AFG1联合处理对A549细胞中Cyp450酶的影响体外给予IL-6和AFG1联合作用A549细胞后,Real-time PCR检测结果显示,AFG1和IL-6联合作用,明显上调Cyp1A2、Cyp2A6和Cyp2A13在m RNA水平的表达(P<0.05);而AFG1单独作用对Cyp2A6和Cyp2A13的表达没有影响。Western Blot检测结果显示,AFG1和IL-6联合作用明显上调Cyp1A2、Cyp2A6、Cyp2A13蛋白的表达,与m RNA水平检测结果一致(P<0.05)。这表明IL-6可能通过上调Cyp1A2、Cyp2A6和Cyp2A13的表达,促进AFG1在A549细胞中的代谢活化,加剧A549细胞DNA损伤。5 STAT3通路在AFG1和IL-6联合作用上调P450活性和诱导A549细胞氧化应激损伤中的作用5.1 AFG1和IL-6联合作用对STAT3信号通路激活的影响Western Blot结果表明,AFG1和IL-6联合处理组p-Stat3蛋白在细胞核中表达明显增高(P<0.05)。5.2 STAT3特异性阻断剂(Cpd188)预处理预处理在AFG1和IL-6联合作用上调P450活性和诱导A549细胞氧化应激损伤中的作用Western Blot结果表明,联合处理组中高表达的p-Stat3可被Cpd188有效抑制(P<0.05)。给予Cpd188预处理后,联合处理组中Cyp1A2、Cyp2A6和γH2AX的蛋白表达明显低于未经Cpd188预处理的联合作用组(P<0.05),而Cyp2A13并没有明显差异。另外,用Real-time PCR方法检测了经Cpd188预处理的联合组中A549细胞Cyp1A2、Cyp2A6、Cyp2A13的m RNA水平,结果与蛋白水平表达一致。表明IL-6通过激活STAT3信号通路上调A549细胞中Cyp1A2和Cyp2A6的表达,促进AFG1在细胞中的活化而加剧A549细胞的DAN双链断裂损伤。但IL-6不通过STAT3通过调控Cyp2A13的表达。5.3 STAT3si RNA干扰在AFG1和IL-6联合作用上调P450活性和诱导A549细胞氧化应激损伤中的作用FCM检测结果发现,Stat3si RNA+4μg/ml AFG1+20μg/ml IL-6处理组中A549细胞的ROS生成明显低于NCsi RNA+4μg/ml AFG1+20μg/ml IL-6处理组(P<0.05)。Western Blot检测结果发现,Stat3si RNA+AFG1+IL-6处理组中Cyp1A2、Cyp2A6和γH2AX的蛋白水平明显低于NCsi RNA+AFG1+IL-6处理组(P<0.05)。进一步证明提示IL-6通过STAT3信号通路上调A549细胞中Cyp1A2和Cyp2A6,促进AFG1诱导的AT-II细胞DNA双链断裂损伤。6 AFG1和IL-6联合作用对于A549细胞存活的影响MTT检测结果显示,AFG1与IL-6联合处理与AFG1单独处理相比对A549细胞的存活没有影响。Western Blot方法检测跟凋亡和增殖相关的蛋白(包括BCL-XL、Cyclin D1、Bax的表达),结果显示,这些蛋白在IL-6和AFG1联合作用组的表达明显高于AFG1单独处理组(P<0.05)。提示IL-6一方面促进AFG1致AT-II细胞氧化应激损伤,同时激活与增殖相关蛋白,促进细胞存活,在慢性炎症微环境中,这种效应可以导致DNA损伤细胞增加。综上所述,我们认为在AFG1诱导的慢性炎症反应中,除了AFG1本身可以诱导AT-II细胞氧化应激损伤外,IL-6激活STAT3信号通路,上调Cyp1A2和Cyp2A6表达,促进AFG1代谢活化,进一步提高细胞内氧化应激反应,加剧细胞的DNA损伤,而IL-6同时激活增殖相关蛋白,诱导DNA损伤细胞存活,进而增加细胞突变几率。结论:1 IL-6可以增强AFG1诱导的氧化应激反应,增加AT-Ⅱ细胞DNA双链断裂损伤。2在AFG1诱导的慢性炎症微环境中,IL-6可能通过上调Cyp450酶的表达,增强AFG1在A549细胞中的活化。3 IL-6通过激活STAT3信号通路,上调Cyp1A2和Cyp2A6的表达,促进AFG1代谢活化,进而加剧DNA双链断裂损伤。4在AFG1诱导的炎症微环境中,AFG1与IL-6联合作用加剧AT-II细胞的DNA损伤,可能增加细胞突变而发生癌变的几率。