受体的概念起源于100多年前,其提出者是John Newort Langley和Paul Ehrlich。受体作用的基本原理是通过与配体的结合并将这种结合作用所产生的信号传递到效应器,以引起相应的生物效应。受体的变构调节指变构调节剂结合到受体的变构调节位点并使受体的构象发生变化从而改变受体与配体结合能力的一种现象。最早观察到变构调节现象的是Bohr,在血红蛋白结合氧气的过程中,氧分子与血红蛋白的结合可以增强氧分子与血红蛋白的进一步结合,后经研究发现氧分子与血红蛋白的结合改变了其构象从而发生了有利于进一步结合氧分子的变化。1951年,Wyman提出了蛋白的构象可发生转换从而改变对其配体的亲和力,随后Katz等在对N型乙酰胆碱受体的激活和脱敏过程中分离到了处于不同构象的受体,支持了Wyman的观点。1963年,Monod等在阐述酶与底物的作用机理时,首先提出了别构学说。该学说认为,由亚单位组成的别构蛋白,在正常情况下有两种处于平衡状态的构象:活化态和非活化态,二者皆具有结合配基的立体选择部位(Orthosteric site)。当特定的配基与它们结合后,会改变两种状态之间的平衡,增加或者减少对配基呈高亲和力构象的浓度,从而改变对其他分子的亲和力。这就假设了受体上存在第二类位点变构调节位点(Allosteric site),与传统的激动剂识别位点不同的是,配体与变构调节位点结合后一般并不单独产生功能,而是通过改变受体的构象来影响受体与激动性配体的结合能力来产生功能的。因此,变构调节分为正性调节和负性调节,协同系数α是一个判断和衡量一个变构调节正负的重要参数,如果α>1属于正性调节,如果α<1则是负性调节。那么参与变构调节的是受体上哪些结构域或者位点呢?受体蛋白的功能是纷繁复杂的,只有通过形成调节位点才能实现众多的功能,这也决定了这些调节位点必须具有低的保守性,以保证每种调节性配体都是有自己唯一的受体识别结构域和位点的。大多数靶向受体的药物,其药效学的产生主要通过直接与受体的激动剂识别位点结合,起到模拟或抑制内源性受体激动剂的作用。由于不同受体亚型的激动剂识别位点在空间结构上存在较高的保守性,造成这类药物缺少亚型选择性,因而容易产生毒副作用,限制了这些药物的临床使用。近年来,越来越多的变构调节研究结果揭示,变构调节剂可增强配体对受体的亚型选择性和提高药效。参与受体变构调节的关键性氨基酸保守性较低,这就为更具选择性的变构调节药物的研发提供了结构基础。盐酸苯环壬酯(8021),是我所合成的一个比较有代表性的新结构抗胆碱化合物,为M受体的拮抗剂,抗胆碱作用强,副作用弱的特点。研究发现CPG能在动物模型和临床用药过程中有效的预防和治疗运动病,疗效优于东莨菪碱和茶苯海明,对中枢的抑制作用明显低于两者。盐酸苯环壬酯(8021)是一个手性化合物,有两个光学对映体,DM8021是其在体内的主要去甲基活性代谢产物,结构中有一个手性中心,因此也有两个光学对映体R-DM8021和S-DM8021。前期研究发现R-DM8021影响了乙酰胆碱对M型乙酰胆碱受体的结合,以此推断其可能具有一定的变构调节作用。另外R-DM8021对M型乙酰胆碱受体M2和M5的结合能力是不同的,这就为我们确定其在受体上的结合位点提供了理论基础,我们通过分子克隆技术将M2和M5受体进行扦插,并借助Sf9-杆状病毒表达系统表达,通过配体受体结合试验技术来确定参与结合R-DM8021的受体结构域。研究方法:①本研究通过配体受体结合实验技术证实R-DM8021的变构调节作用并确定了其协同系数α,并说明了如何区分一个竞争性的反应和一个负性变构调节反应。②构建M受体(M2/M5)扦插重组体,并在sf9-杆状病毒表达系统中表达,为后续工作研究药物(Gallamine/R-DM8021)在受体上的变构调节位点,奠定了基础。研究结果:1. Gallamine对[H3]- NMS与M受体结合的影响a)饱和实验中:对照组:[H3]-NMS,Bmax = 12.61±1.58 pmol/mg.protein, Kd = 0.27±0.14 nM加入Gallamine之后10μM Gallamine:Bmax=5.57±1.33 pmol/mg.protein, kd=0.85±0.16 nM 1 mM Gallamine: Bmax=8.88±0.15 pmol/mg.protein, kd=0.83±0.04 nM 10 mM Gallamine:Bmax=9.06±0.90 pmol/mg.protein, kd=0.37±0.13 nM。b)竞争抑制实验中,观察到Gallamine的双向调节,因此无法拟合一条曲线,负性协同α=0.24。c)解离实验中,0.01 ?M Gallamine解离速率k=0.078/s, 100μM Gallamine解离速率k=0.005/s。2. R-DM8021对[H3]-N-甲基-东莨菪碱(NMS)与M受体结合的影响a)饱和实验中:对照组:[H3]-N-甲基-东莨菪碱(NMS),Bmax=15.69±1.20 pmol/mg.protein, kd=0.98±0.2nM。加入R-DM8021之后: 0.1 ?M R-DM8021 Bmax=13.54±4.18 pmol/mg.protein, kd=3.59±1.90nM; 10 mM R-DM8021 Bmax=37.73±3.14 pmol/mg.protein, kd=1.21±0.25nM。b)竞争抑制实验中, 10-6-10-2M之间Bmax为对照组的2.4倍, kd=235 ?M ,以此计算出α= 3.02。c)解离实验中,0.01 ?M DM8021解离速率k=0.115/s,100 ?M DM8021解离速率k=0.0045/s。3.构建M2和M5适合在Sf9-杆状病毒表达系统中表达的重组蛋白以及四个M2/M5受体的嵌合体,并用Western blot检测,结果M2和M5重组蛋白表达检测呈阳性。结论:1.明确Gallamine的负性变构调节作用,但是伴随着双向调节。10-8M是一个分界点,小于10-8M配体NMS的结合量随Gallamine浓度的增加呈现正相关;高于10-8M配体NMS的结合量随Gallamine呈现负相关。2.明确了R-DM8021的双向变构调节作用,10-6M是一个分界点。小于10-6M配体NMS的结合量是降低的;高于10-6M配体NMS的结合量是明显增加的,高于未加入调节药物曲线的Bmax。结合功能学实验我们证实,R-DM8021可以在高于10-6M浓度时正性调节NMS与受体的结合,但是负性调节Ach与受体的结合。3.以上研究结果提示:DM8021影响M受体的构象后,对NMS和Ach的结合能力变化是不同的。同一种变构调节剂对受体构象产生影响,这种影响对与已知的能够结合这种受体的不同配体的结合能力的影响是不同的。4.建立了用系列调节药物的浓度对Kapp作图来区别经典的竞争性反应和一个负性的变构调节反应的方法。5.成功建立了M2和M5适合在Sf9-杆状病毒表达系统中表达的重组蛋白以及四个M2/M5受体的嵌合体,为后续的研究打下基础。