内切木聚糖酶是木聚糖降解酶系的重要组成部分,可有效水解木聚糖的β-1,4糖苷键,在造纸、食品、能源、饲料及环境等领域中具有广阔的应用。特别是来源于嗜热微生物的嗜热木聚糖酶,具有高温催化活性、独特的热稳定性等优点,近年来引起国际学术界和工业界的广泛关注。嗜热微生物Dictyoglomus turgidumDSM6724分离自俄罗斯堪察加半岛的乌宗火山,最适生长温度达75oC,其基因组中含有一个潜在的GH11家族β-1,4内切木聚糖酶基因,其与Dictyoglomusthermophilum Rt46b.1的木聚糖酶XynB和Caldicellulosiruptor sp. Rt69 B.1内切木聚糖酶序列一致性分别为81.8％和69%,与其它木聚糖酶的相似性均在60%以下。我们预测该基因编码的木聚糖酶可能具良好的热稳定性,希望通过对其进行研究,发掘性质优良的新型木聚糖酶基因,并对其催化和热稳定性机制进行深入探讨。　　本研究成功地克隆了Dictyoglomus turgidum DSM6724中的β-1,4内切木聚糖酶基因(Dtur_0243),并在大肠杆菌中进行了高效表达。经过菌体破碎、热处理和Ni-NTA亲和层析,获得了纯化的重组蛋白DtX,其纯化倍数为2.68倍,蛋白收率73.6%,纯蛋白产量达830mg/L。酶学性质表征显示,DtX可高效水解多种木聚糖底物,对山毛榉木聚糖底物的比活达825.4U。DtX具有良好的热稳定性和p H稳定性,最适反应温度为80oC,在85oC下的半衰期为300min,在80oC保温10小时活性基本完全保持;最适pH为6.5,在pH4-10之间能维持60%以上的活力。　　对Dt X的氨基酸序列进行分析显示,该酶含有两个结构域,由催化结构域(Catalytic Domain, CD)和碳水化合物结合结构域(Carbohydrate Binding Module, CBM)组成,中间通过一段由14个氨基酸组成的连接肽(Linker)连接。为研究该酶结构域之间的相互作用和结构-功能关系,我们构建了Dt X的两种截短变体,分别是删除了C末端CBM结构域的DtX-CDL,以及删除了CBM结构域和Linker的Dt X-C D。两种截短突变体均以胞内可溶形式表达,且热稳定性及活性都比野生型发生了显著变化。在最适条件下,DtX-CDL及DtX-CD的比活性分别比野生型提高了42.8%和17.92%,达到1441.8U和973.3U;90oC时DtX-CDL半衰期为1400分钟,是野生型的55倍,而DtX-CD在同样温度的半衰期仅有10分钟,比野生型降低了60%,这显示了CBM与Linker对酶性质的关键调节作用。在此基础上,我们通过对Dt X及其突变体进行了结构建模,发现Dt X-C D的催化结构域C末端最后一个β-片层与野生型相比明显缩短。这使其缺失了稳定酶二级结构的相关氢键网络,可能是造成其稳定性下降的主要原因。因此,在该区域引入额外的二硫键、盐桥等稳定作用,有可能进一步提高DtX的热稳定性。本论文克隆了Dictyoglomus turgidum DSM6724中唯一的GH11家族木聚糖酶,并进行了系统的酶学性质表征。该酶具有活性高、热稳定性好、耐受pH范围宽等特点,具有重要的工业应用潜力;通过构建DtX的截短突变体,获得了在分子量、比活性、热稳定性等重要参数上更加优化的突变酶;通过对突变体的结构进行分析,揭示了其催化结构域的C末端对蛋白质稳定性及活性的重要作用,为此类酶的分子改造提供了新思路。