研究背景肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。70%以上的患者就诊时失去手术机会,放化疗成为其主要治疗选择。对于晚期无驱动基因突变的非鳞非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）,培美曲塞联合铂类是首选治疗方案。但培美曲塞原发性耐药及缺乏有效的疗效预测标志物是目前困扰临床的重大难题。甲硫腺苷磷酸化酶（Methylthioadenosine phosphorylase,MTAP）是嘌呤补救合成途径的关键酶。在体内,嘌吟可在二氢叶酸还原酶（Dihydrofolate reductase,DHFR）作用下,通过从头合成途径进行合成,还可以在MTAP参与下,通过补救合成途径由甲硫氨酸代谢合成。培美曲塞是第三代多靶点叶酸抑制剂,可以特异性作用于DHFR,阻断嘌呤从头合成途径。因而,在MTAP缺失的细胞中,阻断DHFR,则彻底阻断了嘌呤合成途径,干扰DNA代谢。正常细胞由于存在MTAP而不受培美曲塞的影响,这种代谢差异构成了抗肿瘤基础。一项Ⅱ期临床研究显示,对MTAP缺失的尿路上皮癌患者,采用培美曲塞治疗疾病控制率可达67%,远高于既往数据8%-28%。但是目前缺少MTAP在肺癌领域的研究。本研究通过临床层面发现在晚期肺腺癌中MTAP高表达与培美曲塞的近期疗效呈负相关,且与KRAS突变相关。通过对NSCLC细胞系检测MTAP本底表达,显示MTAP高表达常见,但MTAP表达对培美曲塞敏感性的预测受KRAS突变影响。多癌种研究显示MTAP与KRAS之间相互影响,但调节机制不明。NSCLC基因组分析显示,KRAS突变在MTAP表达的NSCLC中发生率较高（p=0.003）。因此,解决KRAS突变MTAP阳性细胞治疗抵抗成为主要临床问题及难点问题。由于研究进行时无针对KRAS突变的特异性靶向药物,因此,寻找新的治疗方式或联合治疗方式绕过KRAS突变成为解决问题的关键。结合既往研究经验,放疗不仅可以直接杀伤肿瘤细胞,还会产生DNA片段,潜在激活cGAS-STING通路,促进IFNs及免疫相关趋化因子ILs释放。而甲硫氨酸的直接代谢产物S-腺苷甲硫氨酸是DNA甲基化的主要供体,DNA甲基化是放疗抵抗的重要原因。地西他滨（Decitabine,DAC）是DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）抑制剂,DNMT在DNA复制时要结合DNA并使DNA甲基化复制到子链,而DAC可以与DNMT不可逆结合,阻断DNA复制,直接抑制肿瘤生长。既往研究也证明放疗联合DAC可通过促进MHC I类分子及共刺激信号表达,促进T细胞增殖活性及T细胞介导的细胞毒性,产生协同治疗作用。因此,本研究选择MTAP+/-且合并KRAS突变的NSCLC细胞系,采用放疗±DAC处理,探索不同处理方式调节细胞对培美曲塞敏感性的可行性及潜在作用机制。结果显示联合治疗可通过激活cGAS-STING通路促进I型IFNs表达,并促进免疫相关趋化因子表达,提高MTAP阳性KRAS突变细胞系对培美曲塞敏感性,提高治疗效果。该研究提出了新的治疗靶点,为晚期肺腺癌的疗效预测和治疗疗效的提高提供了新的思路,并为进一步的免疫治疗联合和临床试验的开展提供了方向。第一部分 肺腺癌MTAP表达与培美曲塞化疗敏感性的相关性研究目的:评估晚期肺腺癌组织中MTAP表达与培美曲塞联合铂类化疗疗效的相关性。材料和方法:回顾性收集我院2013年1月-2018年12月经组织病理学和影像学确诊为晚期肺腺癌的患者。所有患者均一线接受培美曲塞联合铂类化疗。采用免疫组化检测患者组织标本中MTAP表达情况。免疫组化评分根据染色强度和阳性染色肿瘤细胞的比例分为3级,0-4分,5-8分和9-12分,其中0-4分定义为MTAP低表达,5-12分定义为MTAP高表达。化疗疗效评估采用实体瘤疗效评价标准RECIST v1.1。p＜0.05认为是有统计学差异。结果:共纳入165例患者,中位年龄59岁。末次随访时间为2019年3月,中位随访时间32.6个月。结果显示MTAP高表达64例,占38.8%。MTAP表达与性别（p=0.41）、年龄（p=0.11）、吸烟状态（p=0.23）、临床T分期（p=0.34）、N分期（p=0.70）以及EGFR突变状态（p=0.41）无明显相关性。近期疗效评价显示:全组无患者达到完全缓解;MTAP低表达组部分缓解率为64.4%,而MTAP高表达组部分缓解率为46.9%,MTAP高表达组客观缓解率（Objective response rate,ORR）显著低于MTAP低表达组（p--0.035）;MTAP高表达组疾病控制率也显著低于MTAP低表达组（79.7%vs 92.1%,p=0.03）。亚组分析结果显示,对于EGFR野生型患者,MTAP高表达组ORR显著低于MTAP低表达组（73.5%vs42.1%,p=0.04）;同样的,KRAS突变患者中,MTAP高表达患者ORR也显著低于MTAP低表达患者（27.3%vs 70.0%,p=0.01）;对于MTAP高表达患者,存在KRAS突变的患者ORR显著低于KRAS野生型患者（27.3%vs 57.1%,p=0.02）。结论:本研究结果显示晚期肺腺癌MTAP高表达显著降低培美曲塞联合铂类化疗的近期治疗疗效。KRAS突变状态影响MTAP高表达患者治疗敏感性。第二部分 MTAP表达对培美曲塞敏感性影响及提高MTAP阳性细胞治疗敏感性的研究目的:1.评估MTAP在肺癌细胞系中的表达,探讨其表达对培美曲塞敏感性的预测价值;2.评估放疗（Radiation therapy,RT）± DAC是否可调节MTAP阳性肺癌细胞系对培美曲塞敏感性。方法:在第一节中,通过Western Blot检测肺癌细胞系中MTAP本底表达,评估MTAP在肺癌细胞系中分布。然后进行细胞毒性实验检测不同细胞系培美曲塞半数抑制浓度（Half maximal inhibitory concentration,IC50）,评估不同MTAP表达状态及不同病理类型的肺癌细胞系对培美曲塞的敏感性。同时,对MTAP（-）A549及MTAP（+）H1944细胞系通过慢病毒包装构建质粒的方法导入或抑制MTAP基因,评估A549及H1944在导入或沉默MTAP之后对培美曲塞治疗敏感性的变化。在第二节中,选择MTAP+/-KRAS突变细胞系,对细胞系进行RT ± DAC处理,评估不同处理方式下细胞系对培美曲塞敏感性的变化及联合治疗对细胞增殖的影响。结果:（1）在第一节中,使用37种肺癌细胞系检测MTAP表达（其中间皮瘤1种）,主要包含肺腺癌21种（56.8%）和鳞癌7种（18.9%）。MTAP（+）为28种（75.7%）,其中腺癌15种（53.6%）,鳞癌5种（17.9%）。随机选择16种细胞系进行培美曲塞敏感性检测。结果显示无论是根据MTAP表达情况,还是根据病理类型,细胞系对培美曲塞的IC50有高有低,无法准确判断。在肺腺癌细胞系之间,MTAP（+）细胞系也存在治疗抵抗与治疗敏感的细胞系。但对于A549细胞系而言,导入MTAP基因之后,其对培美曲塞治疗敏感性显著降低,且导入MTAP之后A549增殖速度明显高于A549原代细胞。同时,MTAP（+）H1944细胞系在沉默MTAP基因后,MTAP（-）H1944对培美曲塞IC50显著降低,即其对培美曲塞敏感性在MTAP阴性之后显著提高。此结果提示MTAP表达与培美曲塞IC50有一定的相关性,但是受潜在未知因素的影响。（2）美国菌种保藏中心信息提示,驱动基因突变（EGFR、ALK和KRAS）可能掩盖了MTAP表达对培美曲塞疗效的预测价值。但由于本研究所检测16种细胞系中仅3种细胞系驱动基因突变阴性,因此无法在驱动基因阴性细胞系中评估MTAP表达是否可预测培美曲塞敏感性,同时也无法对比有驱动基因突变和驱动基因突变阴性细胞系培美曲塞的敏感性差异。临床上有敏感驱动基因突变患者可以直接选择相应的靶向药物,但是KRAS空间结构特殊,难以开发特异性药物,且研究进行时尚未报道有效KRAS靶向药。KRAS可能是与CDKN2A共突变,进而影响MTAP表达,但目前在肺癌领域缺少相关研究。而且,KRAS是独立于MTAP基因之外占据调控主导地位还是KRAS通过调节MTAP基因变化导致新的信号通路激活而影响疗效尚不清楚。本研究的主要目的是解决临床MTAP（+）患者治疗抵抗的问题,因此绕过KRAS突变,探索新的治疗模式成为解决临床问题的途径。放疗可以直接导致肿瘤细胞双链DNA断裂造成肿瘤细胞死亡,并上调肿瘤免疫原性（原位疫苗效应）潜在促进机体免疫反应,为进一步联合免疫治疗提供理论基础。甲硫氨酸代谢产物S-腺苷甲硫氨酸是DNA甲基化的重要供体,而地西他滨可以通过抑制DNA甲基化转移酶抑制DNA甲基化。既往研究也显示放疗联合DAC具有协同治疗作用。因此,本研究进一步探索RT±DAC在改善MTAP（+）细胞系治疗抵抗中的作用。在第二节中,选择KRAS突变且对培美曲塞治疗抵抗的两种细胞系（A549、H1944）进行研究。A549MTAP表达阴性,而H1944MTAP阳性。分为4个组,对照组,单独RT组,单独DAC组和RT+DAC组。首先检测4组细胞在不同处理方式下对培美曲塞IC50的差异,结果显示对A549细胞系,4个组之间IC50无显著差异（均p＞0.05）,而H1944中,RT+DAC组相比对照组显著增加其对培美曲塞的敏感性（IC50:282.4±11.5 nM vs.574.9±26.4 nM,p=0.001）,而单独RT或单独DAC相比对照组略有降低,但无统计学差异（均p＞0.05）。另外,采用培美曲塞（Pem）预处理,对3个实验组分别采用RT、DAC和RT+DAC处理,然后每日检测各组吸光度变化。结果显示A549细胞系中,4组吸光度无显著差别,说明单独RT或DAC及RT+DAC未能调节A549对培美曲塞的敏感性。而H1944细胞系中,RT+DAC组吸光度明显低于对照组,说明RT+DAC提高了H1944对培美曲塞的敏感性。克隆形成实验结果也显示,对A549细胞系,Pem+RT+DAC相比Pem alone,Pem+DAC及Pem+RT克隆形成数无显著差别,而对H1944细胞系,Pem+RT+DAC组克隆形成数显著低于其余三组。结论:MTAP表达在肺癌细胞系常见,MTAP表达与培美曲塞治疗敏感性有一定的相关性,其对培美曲塞敏感性的预测价值可能受驱动基因信号通路特别是KRAS突变的影响。放疗联合DAC可显著改善MTAP（+）细胞系对培美曲塞敏感性,但对MTAP（-）细胞系无显著影响。第三部分放疗联合地西他滨通过激活cGAS-STING提高MTAP阳性肺腺癌治疗敏感性目的:探讨MTAP阳性KRAS突变肺癌细胞系中,RT+DAC是否可通过激活cGAS-STING通路促进Ⅰ型IFNs表达,提高MTAP阳性肺癌细胞系治疗敏感性。并进一步探索cGAS-STING激活之后是否可促进免疫相关趋化因子表达,潜在激活免疫反应,为联合免疫治疗提供理论基础。方法:选择KRAS突变且MTAP（+）或MTAP（-）细胞系,进行RT ± DAC处理,通过RT-PCR检测cGAS-STING信号通路相关分子如TBK1、IRF3等表达,并检测IFNs表达情况。同时,采用RT-PCR检测IL-1、IL-6、IL-8和CXCL10表达情况。采用Western-blot检测cGAS、STING本底表达情况。结果:选择存在KRAS突变的A549MTAP（-）和H1944MTAP（+）细胞系进行研究。首先对两种细胞系进行单独放疗,结果显示H1944在接受12Gy照射时出现cGAS-STING及TBK1、IRF3和IRF7表达升高,而A549接受2Gy或12Gy照射时均未出现明显升高（12Gy照射时IRF3表达略有升高）。同样的,H1944接受12Gy照射出现IFN-α和IFN-β表达升高,2Gy或12Gy照射均未在A549中观察到IFN-α和IFN-β表达变化。A549 接受 2Gy和 12Gy照射IL-1、IL-6、IL-8 和CXCL10表达均未出现升高,H1944中仅IL-1α和IL-lβ在接受12Gy照射时出现升高,2Gy照射未引起H1944中ILs表达升高。在放疗联合DAC之后,无论采用2Gy或12Gy联合DAC,A549中均未观察到cGAS-STING通路激活,但IFN-α和IFN-β在接受12Gy照射时出现表达升高,ILs表达无明显变化。但H1944中,无论是采用 2Gy或 12Gy联合DAC处理,cGAS、STING、TBK1、IRF3 和IRF7 表达均明显升高,IFN-α和IFN-β表达升高,而且IL-1、IL-6、IL-8和CXCL10表达也显著升高。采用G150抑制cGAS表达之后,继续采用放疗联合DAC处理,在H1944中cGAS、STING、IFN-α和IFN-β表达无明显变化。进一步分析cGAS-STING在两种细胞系中本底表达,结果发现cGAS及STING在A549中为阴性,在H1944中为阳性。结论:RT+DAC可通过激活cGAS-STING通路促进I型IFN表达升高,杀伤MTAP（+）肿瘤,cGAS-STING的本底表达可能是联合治疗发挥抗肿瘤作用的关键。放疗联合DAC还可以促进ILs表达升高,潜在激活机体固有免疫或适应性免疫,为联合免疫治疗提供了理论基础。