一、目的糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）是一种由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,发病率较高。而糖尿病足是糖尿病最严重的慢性并发症之一,也是糖尿病患者致残和致死的重要因素。糖尿病足因其创面迁延不愈、高致残率、高治疗费用等特点受到医学界和社会的高度关注,寻求治疗糖尿病足创面愈合的有效方法和药物已成为一项重要的研究课题。甲基莲心碱（Neferine,Nef）是从植物莲种子的绿色胚芽中提取的一种二苄基对苯二酚类生物碱,具有抗癌、抗抑郁、抗氧化和抗炎等多种药理作用。过往研究表明,甲基莲心碱能降低空腹血糖和胰岛素水平,增强雄性大鼠对胰岛素的敏感性,而有希望成为一种抗糖尿病药物。但甲基莲心碱能否用于糖尿病足的治疗至今尚无报导,尤其是甲基莲心碱对糖尿病创面愈合的作用和机制尚未明确。近年来研究表明,长链非编码RNA（LncRNA）是一类长度超过200个碱基的非编码RNA,广泛参与了各种细胞生物学过程。此外,许多药物能通过改变LncRNA表达来发挥其药理作用。但甲基莲心碱是否通过改变LncRNA调控来促进创面愈合还有待研究。本研究的目的:1.证明甲基莲心碱具有促进糖尿病大鼠创面愈合的作用。首先建立糖尿病大鼠创面愈合的动物模型,观察甲基莲心碱处理能否改善创面组织愈合指标、减轻炎症和过氧化反应,促进愈合相关蛋白的表达。然后进一步采用体外高糖诱导的成纤维细胞模型,探讨甲基莲心碱对大鼠成纤维细胞增殖、迁移和愈合相关基因及蛋白表达的影响,确证甲基莲心碱促进糖尿病大鼠创面愈合的作用。2.探究甲基莲心碱促进糖尿病大鼠创面愈合作用的机制。首先研究甲基莲心碱对高糖诱导的成纤维细胞中,长链基因间非蛋白编码RNA 1118（LINC01118）表达的影响,阐明敲减LINC01118对高糖诱导的成纤维细胞增殖、迁移和愈合相关基因和蛋白表达的作用。之后研究甲基莲心碱对LINC01118的核转录因子SP1表达和miR-766-3p/RIPK1轴的影响。二、方法1、甲基莲心碱促进糖尿病大鼠创面愈合作用研究动物模型研究:用高脂同时用低剂量的STZ建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型,用皮肤活检穿孔机器制造直径10mm的全层皮肤创面模型。于建模后第1、7和14天测量并记录各组的创面面积,计算创面愈合比;于第14天检测血糖、血脂和血胰岛素水平;于第14天取创面组织检测过氧化和抗氧化指标（MDA和SOD）水平以及炎症细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）表达;测定胶原蛋白含量,使用Western Blot检测大鼠创面组织中VEGF、Collagen-1和α-SMA蛋白表达水平,通过HE染色观察创面组织愈合情况。细胞模型研究:建立体外培养的高糖诱导的大鼠成纤维细胞模型。采用MTT法检测甲基莲心碱对成纤维细胞增殖活性的影响;流式细胞术检测甲基莲心碱对成纤维细胞凋亡的作用;划痕法检测甲基莲心碱对成纤维细胞迁移,反映创面愈合的影响;用RT-qPCR、Western Blot和免疫荧光检测VEGF、Collagen-1和α-SMA基因和蛋白表达水平。2、甲基莲心碱促进糖尿病大鼠创面愈合机制研究采用RT-qPCR探究甲基莲心碱治疗组糖尿病大鼠血清和创面组织中LncRNA表达;RT-qPCR检测给予甲基莲心碱处理后高糖诱导的成纤维细胞中LINC01118表达;分别采用MTT、流式细胞术和划痕实验检测用ShRNA敲减LINC01118后对高糖诱导的成纤维细胞增殖、凋亡和迁移的影响;RT-qPCR、Western Blot和免疫荧光法检测敲减LINC01118对成纤维细胞中VEGF、Collagen-1和α-SMA表达的影响;通过生物信息学分析筛选LINC01118下游潜在的miRNAs及其下游潜在的靶基因;RT-qPCR检测miRNAs及其下游靶基因和转录因子SP1在高糖诱导的成纤维细胞中的表达;用双荧光素酶报告基因实验验证 LINC01118 与 miR-766-3p、miR-766-3p 与 RIPK1,以及 LINC01118 与SP1 之间的关系;RT-qPCR 检测 LINC01118、miR-766-3p、RIPK1 和 SP1 在甲基莲心碱治疗组糖尿病大鼠创面组织和血清,以及高糖诱导的成纤维细胞中表达;通过共同敲减LINC01118、敲减RIPK1和miR-766-3p抑制剂以及功能回补实验,评估LINC01118/miR-766-3p/RIPK1轴对糖尿病创面愈合的影响。三、结果1、甲基莲心碱有促进糖尿病大鼠创面愈合作用。动物模型研究表明,甲基莲心碱能够加快糖尿病大鼠的创面愈合,抑制大鼠创面组织脂质过氧化和炎症反应,增加胶原蛋白含量和创面愈合相关蛋白VEGF、Collagen-1和α-SMA的表达。甲基莲心碱给药组大鼠从第7天起创面愈合加速,创面收缩明显。细胞实验结果显示,甲基莲心碱能显著抑制高糖诱导的成纤维细胞凋亡,促进细胞划痕愈合,抑制炎症因子释放,增加VEGF、Collagen-1和α-SMA表达。2、甲基莲心碱促进糖尿病大鼠创面愈合的机制。结果显示:甲基莲心碱能显著抑制糖尿病动物创面组织和高糖培养的成纤维细胞LINC01118的表达。进一步实验证明,敲减LINC01118后能减轻高糖诱导的成纤维细胞凋亡,促进细胞划痕愈合,抑制促炎因子释放,增加创面愈合相关蛋白VEGF、Collagen-1和α-SMA的表达。甲基莲心碱抑制转录因子SP1下调LINC01118表达,LINC01118通过靶向结合miR-766-3p调控RIPK1的表达。LINC01118通过miR-766-3p/RIPK1轴抑制糖尿病创面愈合。四、结论甲基莲心碱对能加快糖尿病大鼠创面愈合过程,促进高糖诱导的成纤维细胞增殖以及创面愈合相关蛋白的表达。甲基莲心碱促进创面愈合的机制与LncRNA密切相关。甲基莲心碱通过抑制转录因子SP1的表达,下调LINC01118/miR-766-3p/RIPK1轴,发挥其药理药效作用。