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木瓜蛋白酶是一种从番木瓜乳汁中分离提取的蛋白水解酶,因其蛋白水解能力强,具有较宽的温度和pH值适应性而广泛应用于医药、食品、纺织、制革、饲料及染料等行业。因此,探索高品质木瓜蛋白酶的纯化方法和分离机制具有重要的实际意义和理论价值。本实验将金属螯合亲和配基引入双水相中,对木瓜蛋白酶进行亲和萃取,考察了金属螯合亲和成相剂的合成条件,系统优化了木瓜蛋白酶的亲和萃取条件,构建了双水相中酶的亲和分配模型。主要研究结果如下：(1)金属螯合亲和配基的合成：采用环氧氯丙烷法,对聚乙二醇4000(PEG4000)进行活化,选用亚氨基二乙酸(IDA)作为偶联剂,优化反应条件,所得不同金属离子PEG-IDA-Metal中金属离子含量基本相同可达0.97mol/mol PEG,表明所选不同金属离子(Cu2+、Fe3+、Zn2+、Ni2+、Mg2+、Ca2+)与IDA的结合力大小基本一致。(2)亲和双水相萃取木瓜蛋白酶,在比较不同亲和配基对木瓜蛋白酶亲和效果后,选取PEG-IDA-Fe3+为亲和配基,采用BBD (Box-Behnken Design)响应面法优化了亲和双水相萃取木瓜蛋白酶的条件,结果表明：(NH4)2SO4质量分数会显著影响木瓜蛋白酶在亲和双水相中的分配行为,其次是PEG-IDA-Fe3+质量分数和PEG质量分数,而在所选范围内的pH并未对酶的分配行为构成显著影响。得出最优萃取的条件组合为：pH=6.9、PEG质量分数16%、(NH4)2SO4质量分数20%、PEG-IDA-Fe3+质量分数3%,此条件下酶活回收率(Y)和蛋白浓度比(Kp)分别为90.50%和1.85。而对木瓜蛋白酶在萃取前后UV-vis吸收光谱和FT-IR吸收光谱的检测发现,其特征吸收峰未发生改变,表明亲和双水相并未损害木瓜蛋白酶的特征结构。(3)通过对大量基础实验数据的研究,采用Mathematic软件对模型进行了回归,采用最小二乘法进行参数拟合,建立双水相中木瓜蛋白酶的亲和分配模型。模型将亲和双水相中酶的分配系数K与各组分浓度差、金属离子浓度相关联,得出了较为简单的模型表达式：经验证,实验值和预测值相对误差在15%以内,能较为准确的预测酶在亲和双水相中的分配行为。论文采用PEG-IDA-Fe3+为亲和配基,探讨了木瓜蛋白酶在金属螯合亲和双水相中的分配行为,并建立了酶的亲和分配模型,具有一定的创新性。项目支持：本课题的研究在国家自然科学基金(No.31260401)资助下完成。