双胎妊娠与单胎妊娠比较，不良妊娠结局发生率明显增高。约83％的双胎妊娠合并有一种以上的妊娠并发症。 无论是单胎抑或双胎妊娠，成功妊娠的维持与母胎间正常的免疫耐受密切相关。在妊娠期间，胎儿能在母体宫腔内顺利发育而不被排斥，目前已阐明其主要原因是滋养细胞不表达经典的主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类分子，只表达非经典的MHC Ⅰ类分子：人白细胞抗原G(HLA-G)等。HLA-G维持妊娠的机理包括：(1)直接或间接抑制自然杀伤(NK)细胞；(2)与蜕膜组织中的T细胞结合，抑制T细胞杀伤；(3)调节T辅助性细胞因子分泌，促使Th2偏移。(4)可溶性HLA-G分子通过激活Fas/FasL旁路，引起活化母体CD8<->T细胞的凋亡。 研究HLA-G基因多态性是探讨HLA-G分子功能的重要途径。通过对基因多态性的研究可以为疾病的预测和诊断提供依据。综合文献，关于单胎HLA-G外显子2、3、4等编码的基因多态性和妊娠结局的研究中，结论存在不一致，有认为HLA-G的表达和基因多态性关系不大，也有认为HLA-G的基因多态性与自然流产、子痫前期及胎儿发育迟缓等密切相关。而近年发现HLA-G的3’非转录区(3’UTR)第8外显子中的14bp缺失/插入位点(14-bp/14+bp)多态性与妊娠维持的关系密切，成为关注热点。国外在对单胎妊娠的研究中证实HLA-G第8外显子基因多态性可能影响HLA-G转录和蛋白表达，与不良妊娠结局(包括流产、子痫前期、胎盘早剥、胎儿发育受限等)有显著性关联。国内研究未见关于HLA-G第8外显子多态性的研究报道。 双胎妊娠属高危妊娠，其妊娠期的免疫耐受状况目前尚不清楚，但早在上世纪七十年代，就有学者提出双胎妊娠较单胎妊娠携带的组织相容性抗原量明显增高，推测这种特殊的胎儿抗原超负荷对妊娠结局有一定的影响。有文献提示双胎妊娠较单胎妊娠免疫呈Th2偏移。关于基因多态性的研究中发现双胎妊娠胎儿某些基因的多态性对妊娠结局可产生影响，如胎儿携带IL-1拮抗受体第2等位基因(ILlRN*2)的频数与双胎发生胎膜早破相关，且显著增加围产儿死亡率。若第一胎胎儿Fas基因启动子出现第670位的A→G的单核苷酸突变(TNFRSF6)，则双胎发生未足月胎膜早破(PPROM)的机率显著性增高。 本研究拟将双胎HLA-G外显子8(14-bp/14+bp)多态性与妊娠结局的关系作为研究课题，并探讨胎盘HLA-G外显子8基因多态性和HLA-G表达量的差异，从基因、RNA转录和蛋白表达水平和临床结局系统研究HLA-G在双胎妊娠的表达状态，并通过对母体外周血sHLA-G的检测分析其与双胎HLA-G基因表达关系，探讨临床应用价值。了解双胎妊娠中的母胎耐受机制，以期对改善双胎预后和提高辅助生育技术的成功率及安全性提供参考资料。 第一章：双胎胎盘HLA-G第8外显子基因多态性 本研究共收集双胎病例125例，并取同期分娩正常单胎44例作为对照。采用多聚酶链反应一序列特异性引物法(PCR-SSP)检测双胎胎盘该位点的多态性，并通过基因测序证实。探讨双胎HLA-G第8外显子基因多态性分布，与正常单胎进行比较，探讨HLA-G在双胎妊娠维持上所起的作用。 结果提示： 1．正常单胎和双胎妊娠胎盘第8外显子14+bp、14-bp等位基因及各基因型频率总体分布差异无显著性(P＞0.05)。双胎妊娠总14+bp基因频率为308％，高于单胎妊娠27.3％，双胎妊娠中14+bp/14+bp基因型比例10.8％，高于单胎 4.5％，但无显著性差异(P>0.05)。 2．双胎妊娠两个胎盘基因组合均为14+bp／14+bp分娩孕周显著(31.5±6.1周)低于其他基因组合型(P<0.05)。 3．自然受孕双胎及单绒毛膜双胎两胎间HLA-G基因多态性一致性高，但在不同一性双胎分布无显著性差异。自然受孕组以两胎均为14-bp／14+bp杂合子组合最多(40.7％)，辅助生育组以两胎均为14-bp／14-bp组合最多(37.9％)。 4．单绒毛膜双胎中有两例胎儿基因型不一致，均为自然受孕。 5．两胎14+bp等位基因总频数大小在双胎合并子痫前期病例中有显著性差异，经检验证实子痫前期发生与两胎14+bp等位基因有关(P<0.05)。 6．14+bp／14+bp基因型围产儿体重显著低于其他两种14bp多态性基因型(P<0.05)。 7．基因型与围产儿性别可能相关，男性围产儿14-bp／14-bp基因组频率较高(47.5％比32.8％，95％可信区间为0.56l～0.571)。 第二章：胎盘HLA-G mRNA的表达 第一章研究已证实胎盘HLA-G第8外显子多态性可能影响双胎妊娠的妊娠结局。而HLA-G第8外显子3’UTR区含有决定mRNA分布、调节mRNA稳定性及控制mRNA转录起始的信号，因此14bp多态性与HLA-GmRNA的选择性剪接以及蛋白合成可能密切相关。本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应检测HLA-GmRNA在胎盘的表达量，探讨不同基因型HLA-G的转录调控差异。 结果： 1．双胎胎盘3种14bp多态性基因型中，14+bp／14+bp基因型mRNA表达量明显下降(P<0.05)，而14-bp／14-bp与14-bp／14+bp两种基因型表达量无显著性差异。 2．相同基因型的单胎妊娠与双胎妊娠转录表达量无显著性差异。 第三章：胎盘HLA-G蛋白的表达 本研究通过免疫组化和Western Blot方法检测HLA-G蛋白在胎盘上表达的定位和表达量，探讨HLA-G蛋白表达与双胎胎儿第8外显子基因多态性的关系。 结果： 1．免疫组化检测胎盘HLA-G蛋白，双胎妊娠三组基因型比较，14+bp／14+bp组表达程度明显低于其余两组(P=-0.001)。 2．单胎妊娠组和双胎妊娠相同基因型比较，其HLA-G蛋白表达均无显著性差异(P>0.05)。 3．孕中晚期胎盘HLA-G蛋白特异性表达在绒毛外细胞滋养层细胞，阳性部位为胞浆和胞膜，绒毛细胞几乎不表达。子痫前期胎盘HLA-G蛋白表达显著下降，且出现胎盘绒毛稀少、血管减少、部分血管管壁增厚等病理改变。双胎妊娠PE组与非PE组14-bp／14-bp及14-bp／14+bp两种基因型HLA-G蛋白表达阳性率均无显著性差异(P>0.05)。PE组14+bp／14+bp基因型HLA-G蛋白表达R±SD<,R>值为(0.37±0.07)，非PEl4+bp／14+bp基因型组R±SD<,R>值为(0.63±0.10)，两者差异有显著性(P<0.05)。 4．Western B10t方法检测HLA-G蛋白表达条带，孕早期绒毛组织与孕晚期胎盘差别不明显，主要异构体均为HLA-G1／5。 5．Western Blot方法检测双胎妊娠胎盘三种基因型HLA-G蛋白(HLA-G1／5)表达，14+bp／14+bp组比较其他两组，条带灰度比值显著性降低(P<0.05)。14-bp／14-bp与14-bp／14+bp组间比较差异无显著性(P=0.550)。 第四章：双胎妊娠母体外周血sHLA-G检测 本研究采用双抗体夹心ELISA的方法，以期探讨妊娠中晚期母体外周血可溶性HLA-G与胎儿HLA-G第8外显子基因多态性之间的相互关系，以期了解其临床检测应用价值。 结果： 1．双胎妊娠孕妇外周血sHLA-G(73.1±23.8)U／ml显著高于单胎妊娠(37.8±27.0)U／ml(P<0.01)。 2．双胎妊娠母体外周血sHLA-G浓度与胎盘第8外显子基因多态性无关，且与分娩孕周无显著性关系(P>0.05)。 3．合并子痫前期双胎病例共16例，母体外周血sHLA-G浓度(60.9±27.7) U／ml，未合并子痫前期双胎病例47例，母体外周血sHLA-G浓度为(69.5±18.8)U／ml，两组比较差异无显著性(P=0.52)。 结论 1．本研究中单胎妊娠与双胎妊娠胎盘HLA-G第8外显子多态性基因型频率分布无显著差异，中国南方人群HLA-G第8外显子多态性基因型分布由多到少依次为14-bp／14-bp、14-bp／14+bp及14+bp／14+bp。 2．孕中晚期胎盘存在HLA-G的转录和蛋白表达，HLA-G转录和蛋白表达水平与第8外显子基因多态性有关，14+bp／14+bp基因型显著降低HLA-G的转录水平和蛋白表达量。 3．双胎妊娠和单胎妊娠HLA-G转录和蛋白表达水平无显著性差异。 4．14+bp／14+bp基因型围产儿出生体重明显降低，但HLA-G第8外显子基因多态性与双胎不同一性无明显关系。 5．14+bp等位基因与双胎合并子痫前期有关，且两胎14+bp等位基因总频数大小与子痫前期发生率显著相关，子痫前期双胎HLA-G蛋白表达明显下降。 6．双胎妊娠母体外周血sHLA-G浓度显著高于单胎妊娠，但浓度水平与HLA-G第8外显子多态性及分娩孕周无关，双胎合并子痫前期者母体外周血sHLA-G浓度有下降倾向。