镉(Cd)是重要的工业和环境污染物之一,可由食物链和饮用水进入人体,对机体肾、肝、肺、睾丸、骨骼及血液系统均可产生毒性,其中肾脏是其损害的主要靶器官。目前,国内对镉诱导肾细胞凋亡的研究较少,而且其机制至今也尚未清楚。因此,本课题通过用携带bcl-2基因的重组腺病毒(由增强型绿色荧光蛋白EGFP标记)感染原代SD大鼠近曲小管细胞,研究Bcl-2蛋白在镉致细胞凋亡中的作用及其机制。为进一步研究镉对肾毒性的机理提供科学依据。　　 1 SD大鼠肾近曲小管细胞原代培养方法的建立　　 本实验采用三种分离方法对SD大鼠肾近曲小管细胞进行培养。它们分别是:机械研磨组织培养法(A法)、机械研磨加0.125％胰酶-0.02％EDTA消化法(B法)、机械研磨加1g/L的胶原酶Ⅰ消化法(C法)。含有10％的胎牛血清、5 ng/mL EGF、100 U/L青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养液,培养于37℃、5％CO2培养箱。　　 通过对三种培养方法的比较分析结果如下:A法,细胞36 h后始见有细胞从组织中伸出,细胞团块较多,贴壁量少,贴壁率30％,细胞生长不良,体积大小不一;B法,细胞24 h左右贴壁生长,但贴壁生长量较少,贴壁率40％,细胞生长不整齐;C法,细胞于24 h左右即可见到贴壁生长,贴壁率70％,细胞基本能长满培养板,形态为多边形,体积较大,细胞团块周围生长出大量的细胞。经多次重复试验发现,C法是三种方法中最好的,细胞生长状况和细胞产量均好于其他两法。　　 2 bcl-2重组病毒滴度的测定及对原代近曲小管细胞的感染　　 将携带bcl-2基因的重组腺病毒(EGFP标记)在HEK293细胞中扩增,收集病毒原液。将对数期生长的HEK293细胞以90μL/孔(1×105/mL)接种于96孔培养板中,培养24 h。分15组,每组2孔。每组加10μL/孔病毒液,浓度分别是:1、1/10、1/102、1/1031/1013病毒原液,最后一组为空白对照。培养20 h后,在荧光倒置显微镜下观察产生绿色荧光的细胞数量,确定计量孔(荧光细胞数少于5个)为第9孔(计为1 U);根据公式10:1稀释的病毒滴度=1 U×10n-1/0.01 mL=10n+1PFU/mL,计算得到病毒滴度为1010 PFU/mL。以不同感染复数(MOI,MOI=病毒滴度×加入的病毒体积/近曲小管细胞数)的重组腺病毒感染原代近曲小管细胞。在荧光显微镜下观察,24 h后MOI≥50感染的细胞有荧光,说明腺病毒成功感染肾近曲小管细胞。3镉致原代细胞凋亡及腺病毒介导的Bcl-2蛋白对其抑制作用的研究　　 研究Bcl-2蛋白的抗镉致原代肾近曲小管细胞凋亡的特性。用含有及不含有bcl-2基因的重组腺病毒感染SD大鼠原代肾近曲小管细胞(Proximal tubulecells,PTC)。即PTC+Ad-bcl-2-EGFP,PTC+Ad-EGFP,PTC三组,同时设定氯化镉浓度梯度和作用时间梯度刺激细胞,经MTT检测细胞增殖的变化、AO/EB双染法测定细胞凋亡率的变化、DNA Ladder测定DNA断裂情况以及Western blot检测Bcl-2蛋白表达量的变化。Western Not结果显示,bcl-2重组腺病毒感染的原代细胞中Bcl-2蛋白的表达量明显高于其它细胞。通过MTT、AO/EB染色和DNA Ladder测定发现,在镉诱导原代PTC凋亡的过程中,Bcl-2过表达可以抑制细胞的凋亡。实验结果揭示,在镉诱导的细胞凋亡过程中,Bcl-2蛋白表现出明显的抗凋亡作用。