嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)在水体环境中广泛分布,常引致淡水鱼类出血性败血症。而在同一生境中的四膜虫(Tetrahymena)常以细菌为食。有研究提出,为了躲避原生动物的捕食和消化压力,细菌会发展出一系列适应性改变,使其存活下来,而这些适应性改变如抗吞噬、抗消化的机制则可能演变为细菌对其他生物的毒力因子。为了探究四膜虫捕食压力对嗜水气单胞菌群体及基因转录水平的影响,本研究选取12株嗜水气单胞菌不同毒力菌株与四膜虫在贫疮环境中共培养,探讨不同毒力菌株对四膜虫捕食的抵抗作用以及在四膜虫捕食压力下细菌基因转录水平的变化,为进一步探究四膜虫在嗜水气单胞菌毒力进化方面的作用奠定基础。1.嗜水气单胞菌不同毒力菌株与四膜虫共培养过程中的相互作用利用斑马鱼模型,测定12株嗜水气单胞菌分离株毒力,在划分毒力菌株与无毒株的基础上,将不同毒力嗜水气单胞菌与四膜虫在贫疮环境(PBSS缓冲液)中共培养,分别检测与四膜虫共培养后细菌的相对存活率。结果发现,四膜虫能捕食不同毒力的菌株,对细菌群体的生长有不同程度影响,毒力较强菌株能抵抗四膜虫的吞噬,甚至裂解四膜虫,共培养12h后,细菌的相对存活率在60%以上,四膜虫的相对存活率却只有30%～60%;毒力较弱的菌株被四膜虫捕食,生长受到严重影响,共培养12h后其相对存活率较低,大部分低于40%,甚至有菌株只有9%,同时细菌也能给四膜虫提供生长所需营养物质,促进四膜虫的生长,使四膜虫相对存活率达到148.5%。2.四膜虫捕食对嗜水气单胞菌不同毒力菌株虫体内存活的影响为探讨嗜水气单胞菌不同毒力菌株被四膜虫捕食后,细菌在虫体内的存活情况,将含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒转入嗜水气单胞菌,并将细菌和四膜虫在贫疮环境中共培养,利用荧光显微镜和透射电镜观察虫体及细菌形态,同时利用细菌细胞活性测定试剂盒结合激光扫描共聚焦荧光显微镜计数四膜虫食物泡中的活/死菌数量。结果发现,当GFP标记菌株被四膜虫捕食后,可观察到四膜虫细胞内迅速出现发出绿色荧光的菌体。不同毒力的菌株均能被四膜虫吞食,但各菌株在四膜虫中的形态和存活比例却不尽相同。透射电镜观察到,强毒株在四膜虫食物泡内细胞形态完整,边界清楚,而弱毒株尤其是无毒株却被四膜虫消化掉,细胞形态不规则,皱缩,边界模糊。细菌细胞活性检测进一步显示,有毒株尤其是强毒株在四膜虫中的存活比例较高,在28%～33%之间,而弱毒株在四膜虫中的存活比例均低于15%。3.SCOTS筛选嗜水气单胞菌暴露在四膜虫环境中的差异转录基因为调查暴露于四膜虫捕食压力下,嗜水气单胞菌毒力菌株基因转录水平的变化,分别提取嗜水气单胞菌单独培养和在四膜虫捕食压力下的总RNA,运用转录序列选择性捕获(SCOTS)技术筛选强毒株NJ-35在四膜虫捕食压力下上调表达的基因。结果共得到116个有效基因,这些基因包括细菌新陈代谢相关基因42个(36.2%)、细胞生存与信号转导相关基因22个(19%)、信息储存与呈递相关基因20个(17.2%)、毒力因子18个(15.5%)、功能未知基因7个(6%)。一些基因的确切功能已在嗜水气单胞菌或其他细菌中有过相关报道,其中不乏毒力相关基因。综上,四膜虫与嗜水气单胞菌不同毒力菌株共培养后对细菌存活的影响不同,强毒株更易在虫体内存活。在四膜虫捕食压力下,嗜水气单胞菌多种基因转录水平发生改变。本结果为揭示嗜水气单胞菌抗四膜虫捕食及毒力进化的机制奠定了基础。