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生物被膜(biofilm)是指微生物在载体表面通过黏附生长并用自身分泌的胞外多聚基质包裹所形成的高度组织化、系统化的多细胞群体结构。生物被膜里的微生物被包埋在自身分泌的胞外多聚物形成的基质网中,并且通过群体感应信号分子相互“通讯”,具有更强的适应外界环境的能力。基质网的主要组分包括胞外多糖,胞外DNA(eDNA)和蛋白质等。一直以来,在生物被膜研究模式菌株——铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中,针对胞外多糖和eDNA的研究较多,然而对于胞外蛋白在生物被膜中的作用却知之甚少。本研究主要以铜绿假单胞菌生物被膜中含量最高的胞外蛋白氨肽酶((P)seudomonas(a)eruginosa(a)mino(p)eptidase,PaAP)作为研究对象,深入发掘氨肽酶在生物被膜中的功能。 本研究发现PaAP是与胞外多聚物基质网关键组分Psl多糖共纯化的主要蛋白,并且通过平衡Psl多糖产量对生物被膜的发育起到调控作用。在生物被膜发育初期,PaAP在翻译后水平抑制Psl多糖合成,从而避免生物被膜过度增长;在生物被膜发育中后期,营养物质相对匮乏时,PaAP通过降解基质网内的蛋白,为菌体生长提供可以利用的营养物质,从而避免Psl多糖被由死亡菌体释放的Psl多糖水解酶(PslG)降解,最终起到维持生物被膜结构和生物量稳定的作用。同时,PaAP有利于铜绿假单胞菌在低温条件下生物被膜的形成,并且增强对喹诺酮类抗生素的耐受性。这些结果进一步表明PaAP增强了铜绿假单胞菌的环境适应性。此外,施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)A1501中的PaAP同源蛋白在其生物被膜形成中也起到类似的营养物质循环再利用功能。 生物被膜内部的微生物之间存在依赖细菌密度的信号交流——群体感应。本研究发现,受群体感应调控的PaAP通过抑制lasI、rhlI和rhlR的转录进而抑制铜绿假单胞菌群体感应系统。转录组分析显示PaAP缺失显著上调71个受群体感应系统调控的基因的表达,如色素合成、毒力因子表达与分泌等相关基因,并影响101个不受群体感应调控的基因的表达,如外排泵、膜蛋白、代谢相关的酶等基因。同时,动植物感染实验结果显示PaAP缺失增强了铜绿假单胞菌的致病性。进一步研究发现,PaAP并不是通过已知的群体感应调控因子来抑制群体感应系统。由于PaAP的胞外催化活性在抑制群体感应中起到至关重要的作用,推测PaAP很可能通过降解胞外蛋白产生自由通过细胞壁的小分子信号,进而抑制铜绿假单胞菌群体感应。 综上所述,本研究揭示了PaAP在铜绿假单胞菌生物被膜发育中的作用及其对群体感应系统的调控,研究结果加强了人们对于微生物生物被膜发育过程以及环境适应性的认识,同时为生物被膜的防控提供了潜在的药物靶标。