β-胡萝卜素高产菌株选育及其蛋白组学初步分析

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β-胡萝卜素是维生素A的前体,被称为维生素A原,是一种重要的天然色素,具有抗氧化、抗衰老、防治心血管疾病的作用,以及抗癌和防治白内障等功效,同时也是理想的食品着色剂和营养增补剂,广泛应用于人造奶油、胶囊、饲料、化妆品等领域。本文首先对三孢布拉霉正、负菌株的形态学进行了研究,再通过对负菌进行紫外诱变处理,平板初筛,摇瓶复筛,遗传稳定性分析,得到了一株β-胡萝卜素产量高、遗传稳定性好的菌株。通过在摇床上优化此菌株的最适发酵培养基,进一步提高了β-胡萝卜素的产量。最后利用蛋白组学初步分析高产菌株和出发菌株的蛋白表达差异。主要结果如下:(1)通过对三种不同干燥方法处理三孢布拉霉菌,根据三种方法的电镜结果,选择自然干燥法处理菌体,并对三孢布拉霉菌的形态学进行了研究。最后通过显微镜与电镜观察结合分析,清楚地表明三孢布拉霉菌的生活史分为无性繁殖和有性繁殖两个阶段。无性繁殖由大孢子囊和小孢子囊产生孢囊孢子,有性繁殖由异宗配合的接合孢子来完成。(2)以负菌为出发菌株进行紫外诱变,平板初筛,摇瓶复筛,遗传稳定性分析,得到了一株β-胡萝卜素产量高、遗传稳定性好的菌株。其β-胡萝卜素产量达到了1271.39 mg/L,较出发菌株提高49.58%。同时通过遗传稳定性实验,26#菌的β-胡萝卜素产量一直维持在1200mg/L以上,所以选定26#菌株作为后续实验菌株。(3)利用高产菌株在摇床上分别对碳源、氮源、植物油、生长因子、玉米浆和金属离子进行了单因素实验,最后通过PB实验确定了最优的发酵培养基,得出26#菌株与正菌混合培养产β-胡萝卜素最佳发酵培养基为:玉米淀粉3.5%,黄豆饼粉2.8%,VB60.005%,花生油 3%,工业玉米浆 2.8%,七水硫酸镁 0.05%,OP10 0.1%,BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)0.05%柠檬酸三钠0.3%混菌粗提液10%,pH值7.4,最终26#三孢布拉霉菌发酵生产β-胡萝卜素产量达1348.56 mg/L。(4)利用26#菌株作为菌种。在5L发酵罐上进行了实验,分别对温度、溶氧和发酵中后期的pH进行了优化,最后确定了发酵温度为28℃,溶氧30%,并在发酵后期将pH控制为7.2,且5L发酵罐发酵至96h时β-胡萝卜素含量为1092.56 mg/L。(5)本文利用原始菌株与突变高产菌株作为材料,进行了相关蛋白质谱的初步分析,通过Bradford蛋白定量和SDS-PAGE电泳对蛋白质进行了定量,然后蛋白质谱初步分析了蛋白的表达情况,最后对相关数据进行数理学分析,分析原始菌株与高产菌株的相关蛋白质发生了差异性的变化:高产菌株中糖酵解途径和磷酸戊糖途径中关键酶活性上调,使得该途径得到增强,是其高产的主要原因之一。相较于原始菌株,高产菌株能量代谢能力强,同时具有更好的抗逆性,对其产物合成起到了促进作用。
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