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2型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)是由多种因素引起的代谢性疾病，其患病人数及发病率在世界范围内不断增加，严重威胁人类健康。与欧美国家T2D患者相比，我国和亚洲T2D患者平均身体质量指数(body mass index，BMI)较低。研究表明我国非肥胖T2D患者占比70%，而且餐后高血糖在中国T2D和亚洲T2D患者中很普遍。因此在我国和亚洲更应该关注非肥胖、餐后高血糖T2D。Goto-Kakizaki(GK)大鼠是多基因缺陷的遗传型非肥胖T2D动物模型，GK大鼠与非肥胖T2D患者有诸多相似特征，例如高血糖症，β细胞功能紊乱以及胰岛素释放减少、外周组织胰岛素抵抗和肝脏糖异生增加等。因此GK大鼠是研究非肥胖T2D的合适模型。骨骼肌是全身餐后葡萄糖摄取的主要器官，高达70%-80%的餐后葡萄糖摄取发生在骨骼肌，因此骨骼肌可能在餐后高血糖的发生发展中发挥着重要作用，但骨骼肌在餐后高血糖的调控机制缺乏全局研究，尤其在T2D早期餐后高血糖的调控几乎无涉及。因此，本研究基于转录组测序研究GK大鼠发病早期骨骼肌mRNA以及长非编码RNA(long non-coding RNA， lncRNA)全局调控机制，并整合基因组变异探索GK大鼠早期高血糖遗传机制，以期填补骨骼肌在早期餐后高血糖中调控机制的空白。具体研究内容如下：
首先，本研究以3周龄和4周龄非肥胖的T2D模型GK大鼠和对照组Wistar大鼠为研究对象，使用转录组测序研究GK大鼠骨骼肌mRNA在GK大鼠早期高血糖的分子机制。转录组数据分析及荧光定量PCR验证了Tbc1d4在3周龄和4周龄GK大鼠骨骼肌中的表达量较Wistar大鼠均显著下调；Pdk4在3周龄和4周龄GK大鼠骨骼肌中的表达量较Wistar大鼠均显著上调；基因Acadl，Acsl1和Fabp4在4周龄GK大鼠骨骼肌中的表达量较Wistar大鼠均显著上调。这其中基因Tbc1d4编码的蛋白参与骨骼肌葡萄糖摄取；基因Pdk4编码的蛋白参与葡萄糖摄取和氧化；而基因Acadl，Acsl1和Fabp4编码的蛋白参与脂肪酸氧化。前人研究表明过表达或敲除Tbc1d4，Pdk4，Acadl，Acsl1和Fabp4能够引起啮齿动物葡萄糖摄取和脂肪酸氧化的改变。因此GK大鼠骨骼肌中这些基因表达失调可能会导致骨骼肌葡萄糖摄取和氧化减少，脂肪酸氧化增加，从而导致GK大鼠发病早期餐后高血糖。
其次，本研究通过对3周龄和4周龄GK大鼠和Wistar大鼠骨骼肌lncRNA测序来探究GK大鼠发病早期骨骼肌lncRNA的调控机制，分析得到GK大鼠骨骼肌中差异表达mRNA和差异表达lncRNA。通过整合差异表达lncRNA与差异表达mRNA相关系数、差异表达lncRNA的靶mRNA预测以及蛋白质与蛋白质相互作用等数据，发现这些差异表达基因(Pdk4，Stc2，Il15，Fbxw7和Ucp3)可能受lncRNA调控参与了葡萄糖不耐受、脂肪酸氧化增加以及高血糖症的产生。NONRATG017315.2-Pdk4，NONRATG003318.2-Stc2，NONRATG011882.2-Il15，NONRATG013497.2-Fbxw7和MSTRG.1662-Ucp3具有高相关系数，而且NONRATG011882.2-Il15，NONRATG013497.2-Fbxw7和MSTRG.1662-Ucp3又是差异表达lncRNA-靶mRNA对。因此3周龄和4周龄GK大鼠骨骼肌中这些差异表达lncRNA-mRNA对NONRATG017315.2-Pdk4，NONRATG003318.2-Stc2，NONRATG011882.2-Il15，NONRATG013497.2-Fbxw7，MSTRG.1662-Ucp3可能参与葡萄糖不耐受、脂肪酸氧化增加，以及高血糖症的调控。
最后，通过对GK大鼠基因组测序以及对PASS(putative artificial selective sweeps)和SAAC(specific amino acid changed)分析，并整合转录组数据，发现基因Ide，Tgm2，Prkcq，Esr1，Zbtb16，Col5a3和Tgm2既是PASS区域基因又是GK大鼠特有的SAAC基因；Egr2，Slc25a20，Ech1，Pcnt，Nrip1，Ephx2，Cmah和Ucp2是GK大鼠特有的SAAC基因；并且这些基因在GK大鼠骨骼肌中的表达量较Wistar大鼠发生显著变化。现有研究表明基因Tgm2，Ephx2，Ucp2，Pcnt和Cmah与胰岛素分泌受损有关；基因Prkcq，Esr1，Zbtb16，Col5a3，Ide，Nrip1，Ech1，Slc25a20和Egr2与胰岛素抵抗有关，其中Col5a3和Nrip1还参与调控骨骼肌葡萄糖摄取。因此上述基因在GK大鼠中的特异性突变及其表达量的显著变化可能与GK大鼠胰岛素抵抗、胰岛素分泌受损和骨骼肌葡萄糖摄取减少有关，可能参与GK大鼠早期高血糖调控。
总结：本研究通过整合3周龄和4周龄GK大鼠和Wistar大鼠骨骼肌转录组数据、基因组数据，结合前人基因敲除敲入研究，尝试揭示GK大鼠早期高血糖分子调控机制以及可能的遗传机制，发现了可能参与GK大鼠葡萄糖不耐受、脂肪酸氧化增强和早期高血糖症调控的差异表达基因，差异表达lncRNA-mRNA对，以及可能参与GK大鼠胰岛素分泌受损和胰岛素抵抗的基因突变。本论文的研究结果为非肥胖T2D早期高血糖骨骼肌分子调控机制提供理论依据，也为中国及亚洲T2D的防控提供潜在的候选靶标。
首先，本研究以3周龄和4周龄非肥胖的T2D模型GK大鼠和对照组Wistar大鼠为研究对象，使用转录组测序研究GK大鼠骨骼肌mRNA在GK大鼠早期高血糖的分子机制。转录组数据分析及荧光定量PCR验证了Tbc1d4在3周龄和4周龄GK大鼠骨骼肌中的表达量较Wistar大鼠均显著下调；Pdk4在3周龄和4周龄GK大鼠骨骼肌中的表达量较Wistar大鼠均显著上调；基因Acadl，Acsl1和Fabp4在4周龄GK大鼠骨骼肌中的表达量较Wistar大鼠均显著上调。这其中基因Tbc1d4编码的蛋白参与骨骼肌葡萄糖摄取；基因Pdk4编码的蛋白参与葡萄糖摄取和氧化；而基因Acadl，Acsl1和Fabp4编码的蛋白参与脂肪酸氧化。前人研究表明过表达或敲除Tbc1d4，Pdk4，Acadl，Acsl1和Fabp4能够引起啮齿动物葡萄糖摄取和脂肪酸氧化的改变。因此GK大鼠骨骼肌中这些基因表达失调可能会导致骨骼肌葡萄糖摄取和氧化减少，脂肪酸氧化增加，从而导致GK大鼠发病早期餐后高血糖。
其次，本研究通过对3周龄和4周龄GK大鼠和Wistar大鼠骨骼肌lncRNA测序来探究GK大鼠发病早期骨骼肌lncRNA的调控机制，分析得到GK大鼠骨骼肌中差异表达mRNA和差异表达lncRNA。通过整合差异表达lncRNA与差异表达mRNA相关系数、差异表达lncRNA的靶mRNA预测以及蛋白质与蛋白质相互作用等数据，发现这些差异表达基因(Pdk4，Stc2，Il15，Fbxw7和Ucp3)可能受lncRNA调控参与了葡萄糖不耐受、脂肪酸氧化增加以及高血糖症的产生。NONRATG017315.2-Pdk4，NONRATG003318.2-Stc2，NONRATG011882.2-Il15，NONRATG013497.2-Fbxw7和MSTRG.1662-Ucp3具有高相关系数，而且NONRATG011882.2-Il15，NONRATG013497.2-Fbxw7和MSTRG.1662-Ucp3又是差异表达lncRNA-靶mRNA对。因此3周龄和4周龄GK大鼠骨骼肌中这些差异表达lncRNA-mRNA对NONRATG017315.2-Pdk4，NONRATG003318.2-Stc2，NONRATG011882.2-Il15，NONRATG013497.2-Fbxw7，MSTRG.1662-Ucp3可能参与葡萄糖不耐受、脂肪酸氧化增加，以及高血糖症的调控。
最后，通过对GK大鼠基因组测序以及对PASS(putative artificial selective sweeps)和SAAC(specific amino acid changed)分析，并整合转录组数据，发现基因Ide，Tgm2，Prkcq，Esr1，Zbtb16，Col5a3和Tgm2既是PASS区域基因又是GK大鼠特有的SAAC基因；Egr2，Slc25a20，Ech1，Pcnt，Nrip1，Ephx2，Cmah和Ucp2是GK大鼠特有的SAAC基因；并且这些基因在GK大鼠骨骼肌中的表达量较Wistar大鼠发生显著变化。现有研究表明基因Tgm2，Ephx2，Ucp2，Pcnt和Cmah与胰岛素分泌受损有关；基因Prkcq，Esr1，Zbtb16，Col5a3，Ide，Nrip1，Ech1，Slc25a20和Egr2与胰岛素抵抗有关，其中Col5a3和Nrip1还参与调控骨骼肌葡萄糖摄取。因此上述基因在GK大鼠中的特异性突变及其表达量的显著变化可能与GK大鼠胰岛素抵抗、胰岛素分泌受损和骨骼肌葡萄糖摄取减少有关，可能参与GK大鼠早期高血糖调控。
总结：本研究通过整合3周龄和4周龄GK大鼠和Wistar大鼠骨骼肌转录组数据、基因组数据，结合前人基因敲除敲入研究，尝试揭示GK大鼠早期高血糖分子调控机制以及可能的遗传机制，发现了可能参与GK大鼠葡萄糖不耐受、脂肪酸氧化增强和早期高血糖症调控的差异表达基因，差异表达lncRNA-mRNA对，以及可能参与GK大鼠胰岛素分泌受损和胰岛素抵抗的基因突变。本论文的研究结果为非肥胖T2D早期高血糖骨骼肌分子调控机制提供理论依据，也为中国及亚洲T2D的防控提供潜在的候选靶标。