前言　　帕金森病(Parkinsonsdisease，PD)是一种中老年常见的运动障碍疾病，以黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元变性缺失为主要病理特征的中枢神经系统退行性疾病。PD的病因及机制尚不清楚，但近期大量研究发现神经炎症反应对激发或加重DA能神经元变性起着非常重要的作用。黑质纹状体内小胶质细胞激活并释放大量前炎性因子，并破坏血脑屏障的结构和功能。已经证实血脑屏障的破坏促进PD的进展。多种不同的PD模型均能发现血脑屏障结构和功能的破坏，而保护血脑屏障结构和功能的完整性可以缓解PD的进展。在PD中血脑屏障功能受损，加重神经元损伤及死亡，其具体调节机制尚不明确。近期一些研究发现多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PAPP]在其中发挥重要作用。PARP是一种富含核染色质的多功能核酶，在脑外伤和缺血再灌注时激活，PARP对血脑屏障结构和功能的破坏发挥重要作用。　　目前PARP是否对神经炎症介导的血脑屏障结构和功能的破坏发挥作用尚无报道。我们应用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)介导的PD模型，验证PARP抑制剂3-氨基苯甲酰(3-aminobenzamide，3-AB)能否缓解血脑屏障结构和功能的破坏，并保护黑质纹状体内DA神经元，为PD的防治提供理论与实验依据。　　方法　　1、实验动物分组　　实验大鼠随机分成三组:对照组（注射等量灭菌生理盐水大鼠）(n=40)，LPS组(n=60)和LPS+3-AB组(n=55)。进一步根据注射LPS时间不同，将LPS组又分为0h组(n=5)，6h组(n=5)，12h组(n=20)，18h组(n=5)，24h组(n=5)，72h组(n=5)，7d组(n=15)。其中，12h组5只用于血脑屏障通透性的测定，5只用于免疫组化分析，5只用于ELISA检测;5只用于Westernblot检测，;7d组5只用于血脑屏障通透性的测定，5只用于免疫组化分析，5只用于ELISA检测。Westernblot检测LPS+3-AB组根据3-AB不同浓度分为:0mg/kg组(n=5)，5mg/kg组(n=5)，10mg/kg组(n=35)，20mg/kg组(n=5)，40mg/kg组(n=5)。　　2、大鼠模型的制备　　(1)LPS诱导的PD模型（LPS组）:以10％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠头部俯卧位固定于立体定位仪上，剪毛，常规消毒皮肤，正中切口，切开头皮、皮下组织和骨膜，根据文献[19]，选择黑质致密部(SNPc)，坐标:前囱后5.5mm，中缝旁开1.8mm，硬膜下8.3mm。按上述坐标用牙科钻钻开颅骨后，用微量注射器注入2μlLPS溶液(浓度5μg/2μl)，给药速度为1μl/min，给药完毕留针10分钟后缓慢退针，以防药液溢出。消毒后缝合皮肤。　　(2)对照组:向中脑注入与LPS等量的灭菌生理盐水，其他条件同模型组。　　(3)LPS+3-AB组:在黑质内注射LPS前10分钟经左侧股静脉注入3-AB，其他条件同模型组。　　3、Evansblue渗透法评估黑质血脑屏障通透性的变化　　4、免疫组化法检测黑质紧密连接相关蛋白claudin-5，occludin，和ZO-1的表达变化　　5、免疫组化法检测黑质TH阳性细胞数的变化　　6、ELISA法检测黑质IL-1β和TNF-α的含量变化　　7、免疫荧光法检测黑质OX-42阳性细胞数的变化　　8、Westernblot法检测黑质ERK1/2，p38MAPK表达的变化　　结果　　1、血脑屏障通透性的变化　　与对照组相比，LPS组注射LPS同侧黑质明显蓝染，黑质内EB的含量显著升高，在注射12h后达到最高值，然后逐渐下降。LPS+3-AB组黑质EB含量随3-AB浓度的升高而显著降低，10mg/kg组，20mg/kg组和40mg/kg组的EB含量较5mg/kg组显著降低(P＜0.05)，三组之间没有统计学差异。　　2、紧密连接相关蛋白claudin-5，occludin，和ZO-1的表达变化　　应用免疫组化法检测各组黑质claudin-5，occludin和ZO-1的表达情况。claudin-5，occludin和ZO-1蛋白在各组大鼠脑组织中均沿血管呈阳性表达。免疫组化结果显示，与对照组相比，LPS组分别显著降低claudin-5，occludin和ZO-1的表达水平(P＜0.05,P＜0.05，P＜0.05)。与LPS组相比，LPS+3-AB组claudin-5，occludin和ZO-1的表达分别显著增加(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05)。　　3、黑质TH阳性细胞数的变化　　与对照组相比，LPS组显著降低大鼠黑质内TH阳性细胞数(P＜0.05);与LPS组相比，LPS+3-AB组的TH阳性细胞数显著增加(P＜0.05)。　　4、黑质IL-1β和TNF-α的含量变化　　ELISA法检测黑质IL-1β和TNF-α的含量结果显示，与对照组相比，LPS注射12h和7d的IL-1β和TNF-α含量均显著增高(P＜0.05)，与LPS组相比，LPS+3-AB组的12h和7d的IL-1β和TNF-α含量均显著降低(P＜0.05)。　　5、黑质OX-42阳性细胞数的变化　　免疫荧光染色法检测发现，对照组大鼠黑质OX-42阳性的小胶质细胞数量较少，呈现出分枝状静息状态，胞体较小，具有细而长的细胞突起，免疫着色较浅。LPS组OX-42阳性细胞数量明显增加，呈现出胞体增大，突触短而粗的激活状态。与LPS组比较，LPS+3-AB组OX-42阳性细胞数量明显下降，大多数阳性细胞呈现出静息状态。　　6、黑质ERK1/2、p38MAPK表达的变化　　应用westernbloting方法检测黑质中ERK1/2，p-ERK1/2，p38MAPK，p-p38MAPK蛋白表达。结果显示，与对照组相比，LPS组的p-ERK1/2/ERK1/2和p-p38MAPK/p38MAPK均显著增加(P＜0.01)。与LPS组相比，LPS+3-AB组的p-ERK1/2/ERK1/2显著下降(P＜0.01)，而p-p38MAPK/p38MAPK显著增加(P＜0.01)。　　讨论　　本研究通过建立黑质内注射LPS诱导的PD模型，并给予3-AB，观察3-AB对PD血脑屏障和DA能神经元的影响，通过测定黑质EB含量评估BBB通透性。实验结果显示，大鼠黑质内注射LPS后，BBB通透性显著升高，在12h达到高峰，随后逐渐下降。免疫组化结果显示LPS注射12h后，BBB紧密连接蛋白claudin-5，occludin和ZO-1的表达显著降低，DA能神经元数量显著减少。以上结果提示LPS诱导的神经炎症显著破坏了BBB的完整性，降低紧密连接蛋白的水平，增加了BBB的通透性。　　PARP是一种多功能酶，具有蛋白修饰和核苷酸聚合作用，参与DNA的复制，转录，修复，基因调控，信号传导及细胞死亡等过程。研究证实，PARP与炎症，自身免疫性疾病等多种疾病密切相关。　　在本研究中，我们发现3-AB可显著抑制LPS诱导的BBB通透性的增加，并且与浓度相关。3-AB10mg/kg组，20mg/kg组和40mg/kg组的EB含量较5mg/kg组显著降低，三组之间没有统计学差异。同时3-AB能缓解LPS组紧密连接蛋白claudin-5，occludin和ZO-1的降低，与LPS组比较有显著差异。以上结果说明PARP抑制剂对LPS诱导的PD模型的BBB有保护作用。这与其他实验中PARP抑制剂有BBB保护作用的结果一致。在本实验中，我们发现给予3-AB明显提高黑质内TH阳性细胞数，与LPS组比较有显著差异，对PD大鼠起保护作用。在炎症等病理情况下，PARP被过度活化，激活相关细胞死亡蛋白，介导细胞死亡。与我们的研究结果相似的是，Outeiro等发现PARP抑制剂能够保护MPP(+)介导的DA能神经元。Yokoyama等证实PARP抑制剂可缓解MPTP介导的神经毒性，阻止神经元的损伤。而且大量研究还发现抑制PARP可缓解不同脏器的炎症反应。　　本研究建立黑质注射LPS诱导的PD模型，应用免疫荧光组化法检测OX-42表达情况，结果显示，对照组黑质OX-42阳性细胞数量较少，且大多数呈静息状态;而注射LPS7天后大量小胶质细胞被激活，细胞突起变短，变成圆形、阿米巴状或杆状。给予3-AB后黑质内OX-42阳性细胞数较LPS组显著减少，而且大多数细胞呈静息状态，说明3-AB显著抑制了LPS诱导的小胶质细胞的激活。　　应用ELISA法检测黑质内前炎性因子IL-1β和TNF-α的水平，结果显示LPS注射后，脑组织中IL-1β和TNF-α的含量显著升高，给予3-AB后，二者分别下降45％，55％。与我们的结果相似的是，Balazs等发现另一种PARP-1抑制剂4-HQN可以抑制LPS诱导的内毒素休克所致的TNF-α的升高，这说明PARP抑制剂有助于缓解炎症反应。我们从试验中还可以看出在LPS注射7天后，局部炎性因子含量仍较高，说明黑质内单次注射LPS可以产生较长时间的炎症反应。　　大量实验证实LPS可通过ERK1/2通路和MAPK通路介导炎症反应，并增加BBB的通透性。因此我们提出3-AB是否通过ERK1/2通路和MAPK通路抑制LPS诱导的神经炎症反应，从而保护BBB和DA能神经元。在本研究中，westernblot检测结果显示，LPS显著提高p-ERK1/2和p-p38MAPK的表达水平，各组脑组织中ERK1/2和p38MAPK的表达无明显变化。给予3-AB明显抑制了p-ERK1/2的表达，而增加了p-p38MAPK的表达。以上结果提示，3-AB对LPS诱导的神经炎症的保护作用中，ERK1/2通路和MAPK通路发挥了不同的作用。　　结论　　1、LPS黑质注射可导致BBB通透性增加，DA能神经元缺失。　　2、PARP抑制剂3-AB可降低BBB通透性，保护DA能神经元。　　3、3-AB显著抑制IL-1β和TNF-α的表达，抑制小胶质细胞的激活。　　4、LPS使p-ERK1/2和p-p38MAPK蛋白表达显著增加，3-AB显著降低LPS诱导的p-ERK1/2的表达，显著增加p-p38MAPK的表达。