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氢气由于其高效、清洁、无污染而被认为是未来最具潜力的能源；生物制氢与其他制氢方法相比，只需在常温常压下进行且底物利用范围广，故具有良好的发展前景。然而，目前已有菌种及其发酵工艺条件优化后的产氢量仍未能到达工业化生产的要求，所以应用分子生物学的手段对菌种及其代谢途径的改造就显得非常有必要。发酵产氢细菌的产氢过程包括以下三种途径：丙酮酸脱羧产氢途径、通过甲酸裂解产氢途径、通过辅酶I(NADH)的氧化还原平衡调节作用产氢。氢酶是一类在微生物体内催化放氢与吸氢的酶，在生物发酵制氢中发挥重要作用。 本文以木糖高效产氢菌Enterobactersp.CN1为研究对象，通过其甲酸代谢产氢、甲酸对木糖产氢的影响、次亚磷酸钠（HPP）对不同碳源产氢的抑制作用；以及甲酸盐代谢途径中甲酸氢裂解酶激活子基因（fhlA）和NiFe-氢酶基因(hycE,hycG)的克隆、表达以及重组菌株的产氢分析，初步阐述了Enterobactersp.CN1木糖产氢代谢中的甲酸盐途径。主要的研究结果如下： 以0、10、15、20mM的甲酸为单一碳源，在pH6和pH7下发酵产氢，发现生成氢气的量几乎等于甲酸的量，而且随着甲酸浓度的增加，菌体浓度有所下降。同时添加10g/L的木糖作为碳源，发现pH7下的产氢量均高于pH6下的产氢量，并且随着甲酸浓度的增加，pH6和pH7下的产氢量均有增加且增加量大于甲酸的量；而菌体浓度也随着甲酸浓度的增加有所增加。进一步的酶抑制剂实验表明，HPP能完全抑制除甲酸外其他碳源的产氢。表明，甲酸在Enterobactersp.CN1木糖产氢代谢中具有重要的作用，推测Enterobactersp.CN1木糖产氢代谢途径中可能具有甲酸盐途径。 为进一步验证Enterobactersp.CN1中甲酸盐代谢途径的存在，利用简并引物克隆分别获得了fhlA基因和NiFe-氢酶基因的部分片段，并通过重新设计引物获得了两个基因的全长开放阅读框。fhlA基因的全长开放阅读框含有2058-bp碱基对，编码一个含685个氨基酸的多肽，其预测分子量大小约为77kD，pI为5.80，与其他产氢菌的该基因具有高度的同源性。NiFe-氢酶具有大小亚基，大亚基基因（hycE）全长开放阅读框含有1710-bp碱基对，编码一个含569个氨基酸的蛋白亚基，预测其大小约为64.89kD，pI为6.24。而小亚基基因(hycG)的全长开放阅读框含有768-bp碱基对，编码一个含255个氨基酸的蛋白亚基，预测其大小约为28.03kD，pI为7.24，这与其他一些菌属的NiFe-氢酶蛋白特征非常相似。进一步的氨基酸多序列比对发现Enterobactersp.CN1的NiFe-氢酶基因与其他一些兼性厌氧产氢菌的NiFe-氢酶具有高度的同源性，且具有典型NiFe-氢酶氨基酸的所有保守区。 以原核表达质粒pGEX-4T-3为穿梭载体，分别构建了fhlA基因和NiFe-氢酶基因的重组表达质粒，实现了FHLA蛋白和NiFe-氢酶在Enterobactersp.CN1原菌中的过量表达。重组菌株的发酵产氢实验表明，与野生菌相比，FHLA蛋白和NiFe-氢酶过量表达的重组菌单位菌体产氢量分别提高了18.8％和23%。