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特定环境可改变微藻细胞内碳素分配,促使某一类碳基化合物在细胞中积累,具体机制尚不明确。我们前期研究发现,在氮限制诱导小球藻(Chlorella sp.HN11)油脂积累的过程中,一个铜胺氧化酶基因2(ChlC4O2)表达上/下调倍数最高。铜胺氧化酶(CuAOs)是一类具有多种生理的功能的胺氧化酶,参与植物细胞分化和对非生物胁迫的反应,以及哺乳动物脂肪细胞的形成和分化。然而小球藻CuAOs的生理作用尚未见报导。为进一步探明小球藻ChlCAO2在氮限制诱导的油脂积累过程中的功能与作用,本研究设置了“全氮”、“氮限制”和“氮限制—氮恢复”三个处理,测定小球藻HN11在0h,24h,48h,72h及96h的CuAOs活性和ChlCAO2基因相对表达量与油脂积累的相关性。进而通过ChlC4O2超表达和RNAi载体的遗传转化获得转化藻株,测定转化藻株油脂积累和ChlCAOs酶活等表型,以期探明ChlCAO2在氮限制诱导小球藻油脂积累中的作用。此外,为探明CuAO在油脂积累中的作用是否存在共性,本研究还测定了在“全氮”、“氮限制”和“氮限制—氮恢复”三个处理下,另外一株小球藻(C.vulgaris C3)的CuAOs活性,莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii CC425)CuAO活性和基因相对表达量,与油脂积累的相关性。实验结果表明,小球藻HN11在全氮培养96h内均无脂质积累。在氮限制处理24h即开始积累油脂,限氮培养24h、48h、72h和96h的油脂相对荧光强度分别是全氮培养的3.03、4.48、4.17和4.63倍;基因相对表达量分别是全氮培养的105、397、808和333倍;酶活性是3.73、7.15、6.37和13倍。限氮48h后经氮恢复(添加0.1 g/L硝酸钠)的藻细胞油脂的荧光强度显著降低,细胞密度也显著性增加(P<0.05);其ChlCAO2的相对表达量在72h和96h下降至6.86%和0.79%;ChlCAOs活性分别下降至70.6%和51.3%。小球藻HN11中的铜胺氧化酶活性,基因表达与油脂积累量显著正相关。衣藻在全氮培养96h内均无脂质积累。在氮限制处理24h即开始积累油脂,限氮培养衣藻在24 h、48 h、72 h和96 h的油脂相对荧光强度分别是全氮的3.17、4.49、7.58 和 5.15 倍;CuAOs 的活性是 3.17、4.49、7.58 和 5.15 倍;限氮培养衣藻在24 h、48 h、72 h和96 h的CuAO1相对表达量分别是全氮对照组的236、721、348、1817倍,CuAO2的相对表达量分别是对照的11、4.7、13和12倍,CuAO3的相对表达量分别是对照的1.64、2.11、5.85和11.5倍。在限氮48h后补充氮素(添加0.4g/LNH4Cl)细,细胞密度显著性增加(P<0.05),油脂积累减少。氮恢复24h和48h的CuAO表达量迅速下降,CuAO1的相对表达量下降至对照0.04%和0.22%,CuAO2的相对表达量下降至0.67%和17.7%,CuAO3的相对表达量下降至3.04%和24.83%,CuAOs的活性分别下降至23.4%和25.2%。衣藻中的铜胺氧化酶活性,基因表达与油脂积累量显著正相关。小球藻C3在全氮培养96h内均无脂质积累。在氮限制处理24h即开始积累油脂,限氮培养24h、48h、72h和96h的油脂相对荧光强度分别是全氮培养的3.4、10.33、9.54 和 12.04 倍,酶活性是 1.97、2.46、4.3 和 5.62 倍。限氮48h 后经氮恢复(添加0.1 g/L硝酸钠)的藻细胞油脂的荧光强度显著降低,细胞密度也显著性增加(P<0.05),氮恢复24h和48h CuAOs活性下降至95.8%和35.7%。小球藻C3中的铜胺氧化酶活性与油脂积累量显著正相关。RACE获得小球藻HN11中ChlCAO2全长序列,与转录组拼接的序列完全匹配。该蛋白含有存在于许多其他常见物种中的两个结构域,一个Cu_amine_oxid N2结构域和一个Cu_amine_oxid结构域。系统进化树分析表明ChlCAO2的氨基酸序列与小球藻sorokiniana CuAO的同源性为56%,与微星藻CuAO的同源性为54%,聚集成一个分支。利用农杆菌介导法将质粒载体转入至小球藻HN11,成功构建ChlCAO2的超表达和RNAi载体。超表达藻株C15、C21、RNAi藻株R13的藻细胞数与野生型藻细胞无显著差异,即转化铜氨氧化酶基因的藻株正常生长。超表达转化藻株C21和C15细胞内中性脂质含量显著高于野生型小球藻(P<0.05),分别是对照的1.6和1.93倍;ChlCAOs活性显著高于野生型藻株(P<0.05),分别是野生型小球藻的2.91倍和3.07倍。RNAi转化藻株R13的油脂相对荧光值相较于野生型小球藻无显著差异,但是ChlCAOs活性显著低于野生型小球藻,是正常培养野生型藻株ChlCAOs活性的24%,ChlCAO2可能在小球藻限氮条件下油脂积累过程中起着关键作用。