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目的:膀胱癌(Urinary bladder cancer,UBC)是目前泌尿系统疾病中常见的恶性肿瘤。有氧糖酵解是恶性肿瘤的显著特征之一,为肿瘤的生长提供能量。乳酸脱氢酶A(Lactate dehydrogenase A,LDHA)是调节糖酵解的关键酶之一,信号转导和转录激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)也可通过糖酵解途径促进肿瘤发生发展。磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C epsilon(Phosphatidylinositol-specific phospholipase Cepsilon,PLCε)在多种肿瘤中高表达,可促进肿瘤的发生和演进。我们前期的研究发现,在膀胱癌T24细胞中,PLCε敲减后可以显著下调LDHA的表达,以及抑制STAT3的活化。然而,PLCε能否通过STAT3、LDHA途径参与膀胱癌T24细胞的有氧糖酵解以及增殖,目前尚不明确。本课题在前期研究的基础上,利用shRNA敲减PLCε表达的慢病毒载体,研究PLCε是否通过STAT3、LDHA途径参与膀胱癌T24细胞的有氧糖酵解以及增殖,及其调控机制。方法:1)收集重庆医科大学附属第一医院泌尿外科从2017年1月至2017年12月实施手术治疗的64位患者,经病理检查证实的64份膀胱癌组织标本和42例相应的癌旁正常组织标本。免疫组织化学染色检测其中PLCε和LDHA蛋白的表达,分析PLCε、LDHA在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达差异,分析膀胱癌组织中PLCε和LDHA表达的相关性,分析膀胱癌组织中PLCε和LDHA的表达与临床病理参数之间的相关性。同时,选取21位患者的膀胱癌及相应的癌旁组织,免疫印迹(Western blot,WB)以及实时荧光定量PCR(Real time quantitative PCR,RT-q PCR)检测其中PLCε、LDHA的蛋白和mRNA的表达,分析膀胱癌组织中PLCε以及LDHA的蛋白、mRNA表达的相关性。2)利用靶向PLCε和非靶向对照短发夹RNA(Short hairpin RNA,shRNA),建立稳定敲减PLCε的膀胱癌T24细胞株及其对照系,分为Blank组(空白组),sh-NC组(非靶向shRNA组),sh-PLCε组(靶向敲减PLCε的shRNA组)。RT-q PCR检测各组细胞PLCε的mRNA的表达。Western blot实验检测各组细胞PLCε和LDHA的蛋白表达情况。糖酵解试剂盒检测各组细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成情况。CCK-8实验检测各组细胞的增殖能力。利用si RNA敲减LDHA的表达后,使用糖酵解试剂盒观察敲减LDHA和PLCε后对T24细胞的葡萄糖消耗、乳酸生成的影响,CCK-8检测其对细胞增殖的影响。构建LDHA过表达的真核载体,利用糖酵解实验以及CCK-8实验观察LDHA过表达后对T24细胞葡萄糖消耗、乳酸生成以及增殖的影响,同时观察LDHA的过表达对PLCε敲减介导的T24细胞葡萄糖消耗、乳酸生成以及增殖变化的作用。3)Western blot检测Blank组、sh-NC组、sh-PLCε组T24细胞中磷酸化STAT3(p-STAT3)和总STAT3的表达情况。使用STAT3抑制剂Stattic(5μM和10μM)处理T24细胞后,Western blot检测细胞STAT3磷酸化水平和LDHA的表达情况,糖酵解试剂盒检测其对T24细胞葡萄糖消耗、乳酸生成的影响,CCK-8检测其对T24细胞增殖能力的影响。再使用STAT3激动剂IL-6(20 ng/ml)处理T24细胞,Western blot检测细胞STAT3磷酸化水平和LDHA的表达情况,观察IL-6对PLCε敲减介导的T24细胞p-STAT3、LDHA表达变化的作用;糖酵解实验以及CCK-8实验观察IL-6对T24细胞葡萄糖消耗、乳酸生成以及增殖的影响,同时观察IL-6对敲减PLCε所介导的T24细胞葡萄糖消耗、乳酸生成以及增殖变化的作用。采用生物信息学数据库JASPAR预测分析LDHA是否为转录因子STAT3发挥作用的靶基因,并预测LDHA启动子可能存在的STAT3结合位点。染色质免疫共沉淀实验(Chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)验证预测结果。双荧光素酶报告实验进一步确认STAT3对LDHA表达的作用情况。4)将Blank组、sh-NC组和sh-PLCε组T24细胞分别种植于BALB/c裸鼠左臀部皮下(随机分成3组,每组5只)。定期测量各组裸鼠移植瘤的大小。一个月后处死全部裸鼠,获取各组移植瘤并称其重量。免疫组化检测各组移植瘤组织中PLCε、p-STAT3、LDHA蛋白的表达情况。结果:1)免疫组化结果表明膀胱癌组织标本PLCε(76.6%)和LDHA(79.7%)的阳性率明显高于癌旁组织标本(分别为31.0%和28.6%;χ~2检验;P<0.001)。与相应的癌旁组织(PLCε,1.738±0.205;LDHA,2.095±0.215;n=42)相比,膀胱癌组织中PLCε(3.672±0.211;n=64)和LDHA(3.859±0.193;n=64)的染色评分也显著增加。而且,膀胱癌组织中PLCε与LDHA的表达呈正相关。Western blot以及RT-q PCR实验发现膀胱癌组织中PLCε、LDHA的蛋白和mRNA表达较癌旁组织均显著增加。膀胱癌组织中PLCε和LDHA的蛋白、mRNA表达呈正相关。PLCε以及LDHA的表达与各临床病理参数不存在有统计学差异的相关性。2)RT-q PCR实验发现与Blank组和sh-NC对照组相比,sh-PLCε组PLCε的mRNA被显著下调(P<0.01)。Western blot发现与Blank组和sh-NC对照组相比,sh-PLCε组PLCε和LDHA的蛋白表达明显降低。葡萄糖消耗实验发现,与sh-NC对照组相比(3.559±0.179nmol/min/1x10~6细胞),PLCε敲减后显著抑制T24细胞葡萄糖消耗(2.422±0.184 nmol/min/1x10~6细胞)。乳酸生成实验发现,与sh-NC对照组相比(6.210±0.323 nmol/min/1x10~6细胞),PLCε敲减后显著抑制T24细胞乳酸生成(3.919±0.291 nmol/min/1x10~6细胞)。CCK-8实验发现PLCε敲减后显著抑制T24细胞增殖。糖酵解实验以及CCK-8实验发现敲减LDHA可以达到与敲减PLCε相同的抑制T24细胞葡萄糖消耗、乳酸生成以及增殖的作用;而且,同时敲减这两个基因具有协同抑制作用。糖酵解实验以及CCK-8实验发现过表达LDHA能促进T24细胞的葡萄糖消耗、乳酸生成以及增殖;而且,LDHA的过表达能够逆转PLCε敲减所导致的T24细胞葡萄糖消耗和乳酸生成的降低以及增殖的抑制。3)Western blot发现与对照组相比,PLCε敲减后显著抑制膀胱癌T24细胞中STAT3磷酸化,对总STAT3的表达没有影响。Western blot实验发现STAT3抑制剂Stattic可抑制T24细胞STAT3磷酸化和LDHA蛋白的表达。糖酵解实验以及CCK-8实验发现抑制剂Stattic可抑制T24细胞的葡萄糖消耗、乳酸生成以及增殖。Western blot发现STAT3激动剂IL-6在介导STAT3磷酸化的同时也上调了LDHA蛋白的表达,而且,IL-6逆转了PLCε敲减所介导的LDHA表达下调。糖酵解实验以及CCK-8实验发现激动剂IL-6能促进T24细胞的葡萄糖消耗、乳酸生成以及增殖,而且,IL-6逆转了PLCε敲减所导致的T24细胞葡萄糖消耗和乳酸生成的降低以及增殖的抑制。生物信息学数据库JASPAR预测发现LDHA可能是STAT3发挥作用的靶基因之一,同时预测了可能与转录因子STAT3结合的3个位点。ChIP结果显示,在使用HA抗体免疫共沉淀外源性STAT3的样品中观察到显著的富集,STAT3可以与LDHA的启动子结合。双荧光素酶报告实验证实,STAT3与LDHA启动子的结合增强了LDHA的表达。4)BALB/c裸鼠皮下注射各组膀胱癌T24细胞后,均能使裸鼠皮下成瘤。与Blank组和sh-NC对照组相比,sh-PLCε组移植瘤生长明显缓慢,移植瘤体积明显小于对照组。接种后第30天,sh-PLCε组移植瘤重量明显轻于对照组。免疫组织化学染色发现sh-PLCε组移植瘤PLCε、p-STAT3和LDHA蛋白表达均明显降低,与体外实验结果相似。结论:1)膀胱癌组织中PLCε、LDHA的蛋白和mRNA的表达明显高于癌旁组织。膀胱癌组织中PLCε和LDHA的表达呈正相关。2)PLCε可能通过调控LDHA的表达影响膀胱癌T24细胞的葡萄糖消耗、乳酸生成以及增殖。3)PLCε可能通过影响STAT3的活化调控LDHA的表达。STAT3能直接转录调控LDHA的表达。4)体内实验中,PLCε敲减后能抑制膀胱癌T24细胞裸鼠移植瘤的生长,PLCε敲减后能下调裸鼠移植瘤中PLCε、p-STAT3和LDHA的表达。