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树木由于受到风力或光等外界因素的影响,导致原本直立生长的树干发生倾斜或者弯曲,为重新定向到一个平衡位置而产生生长应力,产生这种应力的部位被称之为应力木(recation wood)。在被子植物中,应力木产生于倾斜或弯曲树干的上部,称之为应拉木(tension wood)。应拉木与正常木(normal wood)相比具有一种特殊的木质部组织,主要表现在具有较小以及较少的导管细胞,并且其木质纤维细胞的内壁含有一层较厚的胶质层,该层具有纤维素含量高、木质素含量低、结晶度大和微纤丝角小等特性。较高的纤维素含量和较低的木质素含量使应拉木非常适合于制浆造纸和生物燃料的生产。基于木材的特性,应拉木被认为可以作为一种有价值的模式系统用于研究木材的形成。然而应拉木形成的生物学过程中,其转录调控机制还尚不清楚。因此,本研究以木本模式植物毛果杨(Populus trichocarpa)为实验材料,对控制杨树应拉木形成的关键转录因子及其转录调控网络(transcriptional regulatory network)进行了鉴定和解析。获得的主要研究结果如下:(1)以生长4个月大的野生型毛果杨温室植株为研究材料,在相同的生长条件下开展人为弯曲90°实验,分别进行0天、3天、5天、7天、14天和21天6个不同时期的处理。通过组织切片观察和染色,确定不同时期处理后应拉木形成细胞层数。采用激光显微切割(laser capture microdissection)技术精确收集应拉木形成过程中不同发育时期的木质部细胞,通过转录组学分析鉴定出来自56个不同基因家族的1506个差异表达转录因子,表明植物在受到重力或机械力胁迫时具有复杂的调控关系。对1506个差异表达转录因子进行变异倍数的排序,鉴定出在4个时间点(5、7、14和21天)中表达排在第一位的Ptr LBD39,以及具有相同表达趋势的同源基因Ptr LBD22。同时,Ptr LBD39和Ptr LBD22在正常分化次生木质部(对照组,弯曲0天)中几乎不表达,在受到重力或机械力胁迫时表达量逐渐上升。综合以上数据分析说明Ptr LBD39和Ptr LBD22可能参与并诱导应拉木的形成。(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制杨树ptrlbd39单突变体和ptrlbd39/22双突变体。在正常直立生长条件下,突变体在植株的高度、茎节数量、细胞水平结构以及木材组分分析上具有与野生型相似的表型。在重力或机械力胁迫下,ptrlbd39和ptrlbd39/22突变体的应拉木形成受到显著抑制,不对称生长明显减弱,尤其是ptrlbd39/22双突变体以上表型更为显著;同时,ptrlbd39/22双突变体植株中纤维素含量降低约6%,木质素含量增加约18%。以上结果表明,Ptr LBD39和Ptr LBD22在应拉木形成中具有重要的调控作用,并存在功能冗余性。(3)基于CRISPR编辑的ptrlbd39/22双突变体植株转录组学的分析结果显示,敲除Ptr LBD39和Ptr LBD22导致双突变体植株中应拉木形成相关转录因子和功能基因、植物激素信号转导等相关基因的表达受到明显的增加或抑制;同时,突变体植株中木质素单体生物合成酶基因Ptr CCo AOMT2、Ptr C4H2、Ptr CCR2、Ptr PAL1和Ptr PAL3的表达显著上调,与次生细胞壁合成相关的纤维素合酶基因Ptr Ces A4、Ptr Ces A7(又称Ptr Ces A7-A)、Ptr Ces A17(Ptr Ces A7-B)、Ptr Ces A8(Ptr Ces A8-A)和Ptr Ces A18(Ptr Ces A8-B)的表达显著下调。以上结果表明Ptr LBD39和Ptr LBD22可能直接或间接调控这些基因的表达进而影响应拉木的形成。除此之外,在干旱胁迫中起到关键调控作用的Ptr NAC006转录因子在ptrlbd39/22双突变体中显著上调表达。在重力或机械力胁迫下,通过表型与木材组分的分析发现,过量表达Ptr NAC006基因显著抑制了应拉木的形成,并且纤维素含量降低约27%,木质素含量增加约30%。结果表明干旱响应转录因子Ptr NAC006参与应拉木的形成,同时作为负调节因子抑制应拉木的形成。(4)利用染色质免疫共沉淀测序(Ch IP-seq)鉴定Ptr LBD39的直接靶基因。基因组中结合位点分布分析显示,Ptr LBD39结合位点主要富集在启动子区域,占已识别结合位点总数的43.22%,共有512个Ptr LBD39的直接靶基因在3 kb启动子区域内包含一个或多个Ptr LBD39结合位点(p-value<1e-05);与LBD蛋白优先结合的“CGGC”核心序列在Ptr LBD39结合位点中显著富集,说明Ch IP-seq数据分析的可靠性。通过整合分析杨树ptrlbd39/22双突变体的RNA-seq数据和Ptr LBD39转录因子的Ch IP-seq数据,建立了Ptr LBD39介导的杨树应拉木形成的转录调控网络。在该多层级基因调控网络中,Ptr LBD39直接调控26个新的应拉木响应转录因子。综上所述,本研究明确了Ptr LBD39和Ptr LBD22转录因子通过介导杨树应拉木形成的转录调控网络进而调控应拉木的形成,研究结果为利用分子育种技术进行林木材性遗传改良提供新线索。