论文部分内容阅读
第一部分shRNA对恶性胸膜间皮瘤细胞Fibulin-3表达的影响目的:构建纤蛋白-3(Fibulin-3)过表达、沉默对人恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma,MPM)原代细胞的影响,为MPM的治疗寻找新的方法。方法:构建Fibulin-3过表达、短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体,并用MPM原代细胞分别转染空白对照(Control)、Fibulin-3过表达载体(Fibulin-3+Exp)、过表达对照载体(Exp+NC)、干扰载体(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)、干扰对照载体(shRNA+NC)。应用流式细胞术检测细胞周期(PI)及凋亡(Annexin V-FITC/PI)、Real-time PCR 法和 Western blotting 法检测过表达、干扰前后Fibulin-3的表达情况。结果:转染MPM原代细胞后,流式细胞术检测周期结果显示:Fibulin-3+Exp与Control组相比G2期数量增加(p<0.05),差异有统计学意义;shRNA2与Control组相比G2期数量减少(p<0.05),差异有统计学意义。凋亡结果显示:与Control相比,Fibulin-3+Exp组细胞的凋亡下降(p<0.05),差异有统计学意义;而shRNA2组细胞的凋亡率上升(p<0.05),差异有统计学意义。分子水平检测结果显示:Fibulin-3+Exp与Control组比较,Fibulin-3表达水平上升(p<0.05),差异有统计学意义;shRNA与Control组比较,Fibulin-3表达水平下调(p<0.05),差异有统计学意义。结论:构建Fibulin-3基因的过表达及沉默,证实了 Fibulin-3+Exp、shRNA在体外培养MPM原代细胞增殖中的作用,以Fibulin-3为靶点的RNA沉默手段可作为临床MPM治疗提供理论依据。第二部分shRNA沉默Fibullin-3基因对恶性胸膜间皮瘤裸鼠移植生长的影响目的:探讨shRNA沉默Fibulin-3基因对MPM裸鼠移植瘤生长的影响,为进一步诊治MPM提供全新的治疗方法。方法:构建Fibulin-3过表达、短发夹RNA(short hairpinRNA,shRNA)载体,并用MPM原代细胞分别转染空白对照(Control)、Fibulin-3 过表达载体(Fibulin-3+Exp)、过表达对照载体(Exp+NC)、干扰载体(shRNAl、shRNA2、shRNA3、shRNA4)、干扰对照载体(shRNA+NC),将裸鼠随机分为八组,每组3只,选取每只裸鼠腹下部皮下为注射点,精心饲养并每日观察每组移植瘤生长状况。采用形态学观察八组MPM裸鼠移植瘤细胞变化,Real-time PCR法和Western blotting法检测过表达、干扰前后Fibulin-3的表达情况。结果:Fibulin-3过表达载体组瘤体重量及体积明显大于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(p<0.05);干扰组瘤体重量及体积明显小于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(p<0.05);阴性对照组与空白对照组裸鼠移植瘤成瘤体重量及体积差异不明显,无统计学意义(p>0.05)。HE染色表明瘤细胞不规则的腺样结构、交织成束量、细胞核深染数,细胞核分裂象、纤维索的数量等,过表达组均较对照组有所增加,而干扰组有所改善。免疫组化显示,Fibulin-3阳性数量,过表达组较对照组表达明显增加,干扰组与对照组相比,表达有明显的减少;过表达载体组Fibulin-3中mRNA的表达水平明显高于阴性对照细和空白对照组(p<0.05),而干扰组及转录产物的表达明显低于阴性对照组和空白对照组(p<0.05)。八组MPM裸鼠移植瘤细胞中Fibulin-3蛋白相对表达进行分析与mRNA表达相一致。结论:证实shRNA沉默Fibulin-3基因后的MPM裸鼠移植瘤组织在转录及蛋白水平上下调Fibulin-3的表达,从而抑制MPM裸鼠皮下移植瘤的生长、促进其凋亡。为明确shRNA沉默Fibulin-3基因在MPM中的作用机制提供了理论依据。