【摘 要】
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PIM-1蛋白,即莫罗尼小鼠白血病病毒前病毒整合位点（Proviral integration of MMLV,PIM）蛋白激酶1,参与细胞生长、增殖、分化和迁移等功能变化和多种疾病的发生过程。PIM-1蛋白结构和位点特性是这些功能的基础,但由于目前缺乏相应的活细胞研究手段,其活性位点与功能的关系不甚清楚。前期基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy tra
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PIM-1蛋白,即莫罗尼小鼠白血病病毒前病毒整合位点（Proviral integration of MMLV,PIM）蛋白激酶1,参与细胞生长、增殖、分化和迁移等功能变化和多种疾病的发生过程。PIM-1蛋白结构和位点特性是这些功能的基础,但由于目前缺乏相应的活细胞研究手段,其活性位点与功能的关系不甚清楚。前期基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）技术成功构建了在活细胞可视化检测PIM-1活性的FRET探针EPHY,本文分别将其中PIM-1序列的Lys67、Pro81/Asn82和Asp167位点进行负性突变,获得通过荧光可视化检测不同位点突变影响激酶分子功能的一系列FRET探针;通过细胞孵育实验和体外蛋白实验对运用这些探针研究蛋白位点的方法进行验证;之后通过施加PIM-1激酶抑制剂、ATP以及磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）的特异性药物改变PIM-1激酶活性,分析不同位点突变探针的FRET比率以及变化幅度差异,探索Lys67、Pro81/Asn82和Asp167位点参与PIM-1激酶功能和PI3K/Akt/m TOR信号通路的作用。经过测序比对确认EPHY（K67M）、EPHY（P81S＿N82K）和EPHY（D167A）突变体探针构建成功;验证实验结果显示,EPHY及相应突变体探针能正确表征活性位点对PIM-1激酶结构和功能的影响。EPHY（K67M）探针FRET比率显著上升,而在ATP和抑制剂作用下变化的幅度减小;EPHY（P81S＿N82K）探针FRET比率降低,同时在ATP作用下的FRET比率变化幅度也降低;EPHY（D167A）探针FRET比率显著下降,但此探针在药物刺激下的FRET比率变化幅度无明显改变。进一步发现,PIM-1的K67M和P81S＿N82K突变不同程度削弱PIM-1激酶的活性,K67M突变体的弱化最为明显,P81S＿N82K次之。本文构建的突变体探针为研究PIM-1蛋白几个不同活性位点的功能变化提供了可视化检测工具。Lys67位点与PIM-1激酶的底物结合和催化作用相关,直接调控PI3K/Akt/m TOR信号通路;Pro81/Asn82位点参与调节PIM-1蛋白与底物的结合度,同时参与PIM-1激酶的磷酸化调控,从而影响PIM-1激酶与PI3K/Akt/m TOR通路的相互作用;Asp167位点影响PIM-1激酶与底物复合物的结构,但对激酶功能发挥无显著作用。本文基于FRET生物探针技术建立了在活细胞内探究PIM-1蛋白活性位点影响激酶功能和信号分子调控机制的可视化研究方法,可以促进PIM-1激酶所在信号通路上下游效应的机制探究,也为靶向PIM-1激酶的药物筛选开发和疾病治疗提供启发。
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