氨基酸连接酶偶联聚磷酸激酶表达系统催化生成功能性二肽

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二肽因其特殊功能广泛应用于食品、医药、保健品和化妆品等领域。化学合成法合成二肽,反应步骤繁琐、环境不友好,因此近些年利用生物酶催化法生产二肽的研究逐渐兴起。L-氨基酸连接酶(L-amino acid ligase,EC 6.3.2)能以氨基酸直接作为底物合成二肽,但该反应是ATP依赖型,需要外源补充ATP。本研究以大肠杆菌作为宿主,通过构建L-氨基酸连接酶偶联聚磷酸激酶表达系统,无需体外补充ATP(ATP-free)即可合成功能性二肽,通过反应条件优化,提高了二肽的产率,具体研究内容如下:首先,利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 15245)中L-氨基酸连接酶Ywf E和丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae NBRC14081 ATCC 27881)中L-氨基酸连接酶Tab S构建重组菌株,诱导表达并纯化得到Ywf E和Tab S。Ywf E催化丙氨酸(Ala)和谷氨酰胺(Gln)合成丙谷二肽(Ala-Gln)的反应在22-37℃、p H值8-9、Mg2+浓度20-25mmol/L、ATP浓度为30 mmol/L,以及底物Ala和Gln浓度分别为30和60 mmol/L时产率最高:反应6 h时,Ala-Gln产率高达61.0%;Tab S催化2分子Ala合成丙氨酸二肽(Ala-Ala)的反应在37℃、p H值9-9.5,ATP浓度为15 mmol/L时产率最高:反应11 h时,Ala-Ala产率达到47.3%。说明Ywf E和Tab S具有较好的合成不同二肽能力,可以完成多种功能性二肽的合成。其次,以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum 299)、泗阳鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium siyangensis CGMCC 1.6855)基因组为模板扩增聚磷酸激酶基因,并构建重组菌株,诱导表达并分离纯化得到有ATP合成活性的PPK2(1.6855)进行研究。PPK2(1.6855)催化ATP合成的反应在22-37℃、p H值7-9、Mg2+浓度为30 mmol/L、以及底物ADP和六偏磷酸钠的浓度为5和20 mmol/L时产率最高:当反应3 h时,ATP产率高达71.0%。最后,偶联L-氨基酸连接酶Ywf E和聚磷酸激酶PPK2(1.6855)双酶实现Ala-Gln高效合成:Ala和Gln浓度分别为30和60 mmol/L,ADP和六偏磷酸钠浓度为10和15mmol/L,控制反应温度为27℃,p H值7-8,PPK2反应3 h后加入Ywf E,反应7 h后Ala-Gln产率可高达64.1%,与直接添加ATP的产率相当。为减少酶的纯化步骤,降低反应成本,使其更适用于工业放大,利用单质粒和双质粒两种方法搭建了氨基酸连接酶Ywf E和聚磷酸激酶PPK2(1.6855)共表达系统,为实现全细胞催化合成功能性二肽奠定了基础。
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