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背景:恶性肿瘤是危害人类身体健康的重大疾病,传统的抗肿瘤药物在杀死肿瘤细胞的同时不可避免地杀死正常细胞,从而引起常见的不良反应及化疗反应率低。因此提高抗肿瘤药物的靶向性和安全性成为现今肿瘤治疗的新热点,也就是说,寻找肿瘤恶性转化的关键“标靶”,并研究相应的靶向药物已成为目前肿瘤药物治疗研究的重要方向。二十世纪八十年代初期,大量研究结果表明,肿瘤细胞表面高表达叶酸受体(FR),尤其体内叶酸缺乏时;而正常细胞表面很少过表达叶酸受体。同时,美国得克萨斯州西南医学中心的Bart Kamen等发现游离叶酸(FA)可通过叶酸受体介导的胞吞作用进入细胞。Leamon等发现叶酸偶联物与游离叶酸一样也可通过叶酸受体介导的胞吞作用进入细胞。这些发现使叶酸成为肿瘤靶向治疗的可能“标靶”。近些年来,叶酸分子靶向的药物研究方兴未艾,伴随着纳米生物技术在医药学领域的运用,叶酸这一靶向分子已成功的与纳米技术相结合。叶酸主动靶向纳米载体复合物的研究已由传统的纳米粒子(表面未经修饰)逐渐转化为多功能复合纳米粒子,其结构包括载体(高分子化合物)、活性成分(治疗药物)、靶向分子、聚乙二醇(PEG)和对照成像剂等修饰成分。多功能复合纳米粒克服了传统纳米粒在体内大部分迅速被网状内皮系统(RES)所吞噬,难于到达其他肿瘤组织的缺点,从而延长在体内循环的时间,通过肿瘤靶向治疗机制——增强的渗透性和保留效应,完成对肿瘤组织的靶向作用。利用纳米技术进行恶性肿瘤早期诊断和治疗是目前生物技术领域中最前沿的研究课题,纳米生物技术将成为继放疗、化疗和手术治疗后治疗肿瘤的更有效办法。本项研究选用中等分子量壳聚糖(CTS)作为纳米载体,先探讨叶酸—壳聚糖偶联物的制备、纯化及鉴定。通过离子凝胶法制备纳米级微球,并研究其生物学特征。最后利用人子宫颈癌HeLa细胞株与叶酸靶向性纳米药物共培养,研究叶酸靶向性药物在高表达叶酸受体肿瘤细胞的实验应用前景。第一部分壳聚糖纳米微球的制备及体外释放性能目的:优化试验条件,制备合适的壳聚糖纳米微球(CTS/NP),并负载上紫杉醇(PTX),研究负载紫杉醇的壳聚糖微球(CTS-PTX/NP)体外释药性能。方法:采用离子凝聚法和透析法制备CTS/NP及CTS-PTX/NP,激光粒度分析仪测定微球粒径大小和分布,透射电镜观测微球形态学特征,并在磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中对CTS-PTX/NP进行体外释药研究。结果:制备CTS/NP的最佳条件是壳聚糖与多聚磷酸钠(TPP)投量比在3:1～6:1间。制备的CTS-PTX/NP形态规则均质,无粘连,平均粒径179.3 nm,包封率80.0%,载药量20.6%,在8 d内累积释药率接近80.0%。结论:紫杉醇壳聚糖微球性能良好,制备工艺简单,有望成为理想的紫杉醇缓释系统。第二部分叶酸—壳聚糖纳米微球的制备目的:探索叶酸偶联的壳聚糖纳米微球(folate conjugate chitosannanoparticle,FA-CTS/NP)的合成方法。方法:利用叶酸活性酯与壳聚糖分子上的氨基反应形成稳定的酰胺键,合成FA-CTS偶联物。再利用壳聚糖在偏酸性溶液中带正电荷,在高速磁力搅拌作用下能与阴离子凝集的特性,以紫杉醇(PTX)为模型药物,制备负载PTX叶酸偶联壳聚糖纳米微球(FA-CTS-PTX/NP)。通过紫外分光光度法测定叶酸及紫杉醇的含量。结果:由FA、CTS、FA-CTS红外图谱对比可知,成功地将叶酸与壳聚糖偶联。所制备的FA-CTS-PTX/NP,形态均质规则,无粘连,平均粒径282.8 nm,包封率75.4%,载药量9.0%。结论:成功制备叶酸偶联壳聚糖纳米微球。第三部分叶酸—壳聚糖—紫杉醇微球体外实验研究目的:探讨叶酸—壳聚糖纳米微球的靶向性。方法:用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的叶酸—壳聚糖纳米微球(FA-CTS/NP)及普通壳聚糖纳米微球(CTS/NP)与人宫颈HeLa细胞在无FA培养基中共培养,用荧光显微镜观测HeLa细胞对叶酸—壳聚聚微球与壳聚糖微球的摄取差异,及在无FA培养基中添加游离叶酸后,HeLa细胞摄取情况的改变。通过MTT法测定含相同量药物紫杉醇的载药叶酸—壳聚糖微球(FA-CTS-PTX/NP)、载药壳聚糖微球(CTS-PTX/NP)及单药紫杉醇对HeLa细胞生长的不同抑制率。结果:荧光显微镜观测结果表明HeLa细胞对FA-CTS/NP的摄取高于普通CTS/NP。在无FA培养基中添加游离叶酸后,HeLa细胞对FA-CTS/NP的摄取相对减少,而普通CTS/NP则无明显变化。MTT结果显示FA-CTS-PTX/NP组的肿瘤细胞抑制率均显著高于普通CTS-PTX/NP组。结论:叶酸—壳聚糖纳米微球能通过细胞膜上叶酸受体介导内吞入胞,其负载紫杉醇药物纳米微球能特异性抑制高表达叶酸受体肿瘤细胞的生长。