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第一部分A20蛋白在静脉注射LPS所致大鼠急性肺损伤中的变化及意义[摘要]目的本实验通过建立大鼠LPS所致急性肺损伤模型,旨在研究A20蛋白在LPS急性肺损伤的表达变化及意义。方法实验选用SPF级雄性SD大鼠54只,随机分为2个实验组：正常对照组(尾静脉注射PBS,1ml/只,定义为0h)；LPS组(尾静脉注射LPS,10mg/kg,浓度为2mg/ml,根据不同时间点1h,2h,4h,6h,8h,12h,24h,48h分为8个亚组)。所有动物在注射LPS相应时间点放血处死,收集标本,观察光镜(HE染色),检测肺湿干比(W/D),行支气管肺泡灌洗,检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白浓度,BALF中有核细胞总数,BALF中TNF-α、IL-1β水平,肺组织NF-κB DNA结合活性及核蛋白p65水平,肺组织中A20蛋白及mRNA含量,A20定位。结果与正常对照相比,注射LPS24小时后肺W/D、BALF中有核细胞总数(×104/ml)及BALF中蛋白浓度(ug/ml)均明显升高(p<0.05),光镜下可见肺泡间隔增厚,有较多炎症细胞浸润,肺泡腔内可见红细胞和中性粒细胞渗出；注射LPS后,BALF液中TNF-α、IL-1β水平及肺组织中NF-κB DNA结合活性及核蛋白p65含量随时间升高,于注射后2h达高峰,之后逐渐下降,但仍高于注射前,且在24h又发生一过性升高(p<0.05)；肺组织中A20蛋白及mRNA水平也逐渐升高,于注射后2h达高峰,之后下降,但仍高于注射前(p<0.05)；免疫组化示A20在LPS注射后2小时主要表达于肺泡巨噬细胞胞浆。结论1.健康大鼠静脉注射LPS10ml/kg24h后可出现急性肺损伤。2.急性肺损伤时,A20蛋白表达升高,且高峰期与ALI早期细胞因子及NF-κB活性一致。3.A20在急性肺损伤早期明显升高,且表达于肺泡巨噬细胞,由此推测A20可能通过调控肺泡巨噬细胞炎症活性影响肺损伤。第二部分A20对LPS刺激后肺泡巨噬细胞炎症反应的作用及机制[摘要]目的本实验通过建立A20基因沉默及过表达肺泡巨噬细胞株研究A20对LPS刺激后肺泡巨噬细胞炎症活性影响,旨在探讨A20对LPS所致肺损伤的作用及机制。方法实验选用大鼠肺泡巨噬细胞株(NR8383),慢病毒法构建A20基因沉默及过表达细胞株,Western Bblot及RT-PCR鉴定A20表达,并行体外培养慢病毒包装后的A20干扰(A20-SH)、干扰空载(SCR)、过表达(A20)及过表达空载(VEC)细胞株。向培养基中加入LPS进行干预(lug LPS/ml培养基),于刺激后0.5、1、2、4小时收集细胞培养上清液及细胞,ELISA法检测上清液中TNF-α、IL-1β水平及细胞中NF-κB DNA结合活性；Western Blot法检测A20蛋白及核内p65含量；RT-PCR检测A20、TNF-a、IL-1βmRNA含量。结果构建的A20-SH肺泡巨噬细胞株中,A20蛋白及mRNA含量较SCR明显降低(p<0.05),干扰效率达80%；过表达肺泡巨噬细胞中A20蛋白及mRNA含量较VEC明显升高(p<0.05),表达增加10倍以上。LPS刺激后,SCR组及VEC组A20蛋白及mRNA含量升高,且于1h达高峰,之后逐渐下降,而A20-SH组较SCR组明显降低(p<0.05),且始终维持在较低水平,A20组较VEC明显升高(p<0.05)。LPS刺激后各组肺泡巨噬细胞中细胞因子(TNF-α、IL-1β)mRNA及培养上清液中含量、肺组织中NF-κB DNA结合活性及核内p65含量都随时间升高,于1h达高峰,之后逐渐下降；但与SCR相比,A20-SH组明显升高(p<0.05)；与VEC组相比,A20组水平明显降低(p<0.05)。结论1.慢病毒RNAi表达载体及A20过表达载体可分别有效地抑制大鼠肺泡巨噬细胞株中的A20基因表达或增加该基因表达。2.A20基因沉默导致肺泡巨噬细胞NF-κB活性升高,促进TNF-α、IL-1β表达及分泌；反之A20基因过表达能够抑制肺泡巨噬细胞NF-κB活性及TNF-α、IL-1β表达和分泌。3.A20蛋白能够抑制肺泡巨噬细胞炎症反应活性,进而减轻肺损伤。