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寄生虫病害是造成海水动物养殖经济损失最严重的疾病之一。在防治寄生虫病害的药物中,由于分子结构和药理活性的多样性,微生物次级代谢产物已成为新型杀虫药物的重要来源。为了挖掘新型且高效的天然抗寄生虫药物,本研究以解蛋白盐弧菌菌株YCSC6(Salinivibrio proteolyticus YCSC6)为研究对象,通过生物活性跟踪法对其胞外杀虫活性物质进行了分离鉴定,并对活性物质的杀虫机制和安全性进行了研究。同时,本研究还通过代谢组和转录组的联合分析,探讨了菌株YCSC6杀虫活性化合物的生物合成机制。本论文主要的研究内容及结果如下:1.菌株YCSC6杀虫活性物质的分离鉴定及其体外杀虫活性研究本研究通过生物活性跟踪分离法从菌株YCSC6的胞外产物中分离获得两种具有较强杀虫活性的化合物,经核磁共振和质谱鉴定为β-咔啉生物碱类物质——哈尔满(harmane)和去甲哈尔满(norharmane)。体外杀虫活性实验显示:当浓度为3.0mg/L,作用时间为96 h或浓度为4.0 mg/L,作用时间为24 h时,harmane可完全杀死海洋尾丝虫(Uronema marinum),其24 h、48 h、72 h和96 h的杀虫半效应浓度(EC50)分别为1.70±0.11、1.22±0.06、0.99±0.14和0.87±0.12 mg/L;当浓度为3.0 mg/L,作用时间为96 h或浓度为4.5 mg/L,作用时间为24 h时,norharmane可完全杀死海洋尾丝虫,其24 h、48 h、72 h和96 h的EC50分别为2.56±0.15、1.99±0.09、1.56±0.16和1.32±0.02 mg/L;Harmane 2-oxide和norharmane 2-oxide均无杀虫活性。EC50结果显示,harmane的杀虫活性显著高于norharmane。另外,通过对harmane、norharmane、harmane 2-oxide和norharmane 2-oxide之间的构效关系研究,初步确定吡啶环上的2-N是β-咔啉生物碱保持杀虫活性的关键位点,并且1位的甲基取代显著增强了norharmane的杀虫活性。2.菌株YCSC6杀虫活性物质的体外杀虫机制研究本研究以海洋尾丝虫为受试对象,对harmane和norharmane的体外杀虫机制进行了初步探究。结果显示,harmane、norharmane、harmane 2-oxide和norharmane2-oxide均能够无差别地穿过细胞膜进入海洋尾丝虫细胞内,但只有harmane和norharmane能够使海洋尾丝虫由滋养体(trophozoite)转变为包囊(cyst),并诱导产生大量胞内活性氧物质(Reactive oxygen species,ROS);而harmane 2-oxide和norharmane 2-oxide对海洋尾丝虫几乎无影响。过量的活性氧物质引起海洋尾丝虫核膜、细胞膜结构损伤以及DNA裂解,这是导致海洋尾丝虫快速死亡崩解的直接原因。在此过程中,harmane和norharmane吡啶环上的2-N能够将自身电子传递给基态氧从而形成活性氧物质,并且1位甲基取代可显著增强2-N的给电子能力,从而使harmane杀虫活性显著高于norharmane。3.菌株YCSC6杀虫活性物质对大菱鲆的安全性评价本研究通过急性毒性实验结合生物标志物的分析方法,系统地评价了norharmane对大菱鲆(平均体长为12.0±1.0 cm,平均体重为20.0±3.0 g)的安全性,为β-咔啉类生物碱进一步应用于水产养殖寄生虫病的防治奠定基础。急性毒性实验结果显示,当norharmane的浓度≤6 mg/L时,无大菱鲆死亡;当norharmane的浓度≥8 mg/L时,大菱鲆出现死亡现象,并且大菱鲆死亡主要集中在药浴处理后的24 h内,48 h后再无大菱鲆死亡。norharmane对大菱鲆的96 h半致死浓度(LC50)为11.50 mg/L(95%置信区间为10.8-12.2 mg/L),依据《化学农药环境安全评价试验准则》,norharmane对大菱鲆为低毒物质。另外,norharmane对大菱鲆的治疗系数(Therapeutic index,TI)为8.71,较高的治疗系数表明norharmane在防治大菱鲆海洋尾丝虫感染方面具有较好潜在应用前景。另一方面,高浓度的norharmane(16mg/L)对大菱鲆具有一定的毒副作用,会造成不可逆的器官损伤,主要受损器官为鳃和肾脏。组织病理切片显示,当norharmane浓度较低时(4 mg/L),大菱鲆鳃、肝以及肾组织均表现出不同程度的病理变化,但随药浴时间的延长,大菱鲆鳃、肝以及肾的组织显微结构又恢复正常形态。氧化应激生物标志物测定结果显示,norharmane能够引起大菱鲆的氧化应激反应,大菱鲆可通过自身过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的调节以及消耗还原型谷胱甘肽(GSH)来消除氧自由基对机体的损害。药物代谢酶基因相对表达量测定结果显示,norharmane能够引起大菱鲆各器官组织中cyp1a、gst和hsp70的表达变化,其中以肝脏和肾脏中的cyp1a表达变化最显著,分别为对照组的18.73和17.52倍。cyp1a表达量增加迅速提高了肝脏和肾脏中细胞色素P450酶的含量,在细胞色素P450酶催化作用下,norharmane转化为易溶于水的羟基化norharmane或无毒的norharmane 2-oxide,随尿液排出体外,从根本上去除了norharmane对大菱鲆的毒副作用。综合分析norharmane的杀虫活性和安全性,本研究确定norharmane的安全浓度为6 mg/L。4.菌株YCSC6杀虫活性物质的生物合成机制研究本研究通过代谢组学和转录组学的联合分析,探讨了菌株YCSC6杀虫活性化合物的生物合成机制。基于基因-代谢物相关性网络分析,筛选到13个关键调控基因包括ilv I、ilv H、his H、fab Z、gsh A、met17、nrd D、gnd、zwf、doe A、udp、edd和iuc C。菌株YCSC6在13个关键基因的调控下,合成了大量的聚酮类化合物和辛酸,从而使发酵液展现出较强的杀虫活性。同时,菌株YCSC6通过色氨酸代谢途径合成大量的β-咔啉生物碱前体物质,包括L-色氨酸、血清素以及褪黑素,从而促进了β-咔啉生物碱不断合成,使得菌株YCSC6发酵液的杀虫活性不断增强。本研究为深入了解菌株YCSC6杀虫活性物质生物合成的分子机制提供了依据,并为新型抗寄生虫药剂的生物合成奠定基础。