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研究背景及目的炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是一类与免疫相关且病因未明的肠道炎性疾病,主要分为溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）、克罗恩病（Crohn disease,CD）两种亚型。炎症性肠病近年来在全球范围内发病率持续上升已经成为全球范围内的公共卫生挑战。肠道是重要的消化器官和免疫调节器官。研究表明IBD是一类与宿主-菌群失衡密切相关的疾病,由遗传易感性,异常的免疫反应及肠屏障的破坏等多因素引起。人的肠道包括大约1014个微生物,肠道菌群在调节宿主肠道免疫以及建立和维持肠道稳态中具有重要作用。最新研究表明,Treg细胞可以抑制肠道内T细胞对微生物抗原的过度的炎症反应并且调节免疫耐受,在维持组织稳态中起着至关重要的作用。结肠内Treg细胞可以由局部抗原和细菌代谢产物刺激诱导分化产生,能够通过抑制辅助性T细胞和效应T细胞缓解结肠炎症。DSS诱导的动物结肠炎主要表现为肠上皮屏障的破坏,先天免疫反应的过度激活,激活的抗原提呈细胞诱导Th17细胞分化增加,并促进IL-17A的释放加重了结肠炎症。近期的报道表明在高盐饮食的动物模型中Th17细胞也显著被活化,促进IL-17A的分泌,同时有报道表明高盐饮食能降低肠道乳杆菌属的丰度,但具体机制尚不完全明确。这两种模型的发病机制均与Th17升高导致的肠道炎症相关。本研究应用小鼠实验性结肠炎模型及高盐饮食模型,筛选调节肠道免疫的益生菌株并研究该菌株和肠道免疫细胞相互作用的机制,评估其在结肠炎模型中的治疗潜力。研究方法分别构建小鼠高盐饮食模型和实验性结肠炎模型。提取高盐饮食小鼠,实验性结肠炎小鼠和正常对照组小鼠的回盲部粪便样本进行扩增子测序,使用NCBI-16S数据库对每个代表性序列进行物种注释,分析三组小鼠之间差异菌群组成和丰度。随后通过LEf Se差异分析差异菌种,选择组内LDA score＞3的差异菌株作为潜在的益生菌株。C57BL/6J小鼠采用含3%葡聚糖硫酸钠（Dextransodiumsulfate,DSS）的水溶液诱导小鼠实验性结肠炎模型,将C57BL/6J小鼠平均分为正常对照组,实验性结肠炎疾病组和Lactobacillus hilgardii乳酸菌治疗组（以下简称L.hilgardii治疗组）。其中L.hilgardii治疗组给予乳酸菌（L.hilgardii）治疗,正常对照组与实验性结肠炎疾病组给予与L.hilgardii溶液等体积的PBS灌胃。DSS诱导结肠炎8天后进行处理。观察小鼠结肠炎疾病活动指数（DAI）,结肠组织病理学评分（HS）,结肠长度,紧密连接蛋白表达评估结肠及屏障功能损伤表现,通过检测髓过氧化物酶（MPO）,分泌型Ig A（s Ig A）和评估组织病理学评分反映肠道组织炎症严重程度。为了探究益生菌抑制肠道炎症,修复肠上皮屏障的机制,体外采用HT-29细胞系和RAW264.7细胞系进行验证。为明确益生菌在小鼠体内和免疫细胞的相互作用,我们通过酶联免疫吸附实验和荧光定量PCR比较肠道相关组织器官内淋巴细胞相关细胞因子和转录因子差异。在实验性结肠炎和高盐饮食模型中通过流式细胞术检测Treg和Th17细胞占CD4+T细胞的比例。通过扩增子测序分析治疗组与疾病组菌群组成和功能的差异。分离脾细胞体外与菌株共培养,检测细胞群中CD4+CD25+Foxp3+细胞频率,评估益生菌对Treg细胞的促分化作用。研究结果在DSS诱导的实验性结肠炎小鼠模型中,通过分析16s r DNA数据,乳杆菌属丰度相对正常对照组明显下降。关联性分析显示小鼠肠道中的乳杆菌属与多种致病菌呈显著负相关。通过LDA线性判别分析对不同组小鼠计算LDA score,发现与实验性结肠炎组和高盐饮食组相比,正常对照组中乳杆菌属为明显差异菌种,其中Lactobacillus hilgardii在正常对照组中具有较高的重要性。筛选得到特征性菌L.hilgardii并进行下一步实验。我们通过葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导实验性结肠炎,L.hilgardii治疗组在DSS诱导实验性结肠炎基础上通过添加L.hilgardii进行治疗。结果表明L.hilgardii治疗组相对实验性结肠炎疾病组小鼠结肠炎相关症状得到显著缓解,明显改善小鼠体重减轻,结肠缩短,便血,结肠组织炎性细胞浸润,肠屏障功能损伤等结肠炎疾病表现。通过检测小鼠结肠组织和肠系膜淋巴结中相关炎性因子,相比单纯实验性结肠炎组,L.hilgardii治疗组小鼠肠道的炎症相关因子明显降低,P65蛋白的磷酸化水平下调,表明L.hilgardii可能通过抑制NF-κB信号通路的活化。DSS诱导的结肠炎中巨噬细胞活化加重肠道炎症。在体外,LPS刺激可以刺激巨噬细胞（RAW264.7细胞）活化,P38磷酸化水平显著上调,而L.hilgardii细菌裂解产物显著抑制了P38的磷酸化水平。表明L.hilgardii的抑制炎症的功能可能与L.hilgardii调节巨噬细胞MAPK/P38途径的活化相关。为了探究L.hilgardii和免疫细胞的相互作用,我们采用流式细胞术检测高盐饮食及实验性结肠炎两种模型小鼠结肠,肠系膜淋巴结和脾脏中淋巴细胞的比例,发现高盐饮食及实验性结肠炎两种模型小鼠肠道固有层中Th17细胞比例上调。在实验性结肠炎模型中经L.hilgardii治疗组小鼠的结肠固有层,肠系膜淋巴结和脾脏中Treg细胞比例升高,结肠固有层中Th17细胞比例降低。而L.hilgardii处理高盐饮食组小鼠中结肠固有层中Th17细胞比例降低,肠系膜淋巴结中Treg细胞比例升高。我们分离了来自脾脏的淋巴细胞并与L.hilgardii共培养,结果表明L.hilgardii可促进CD4+T细胞向Treg细胞分化。将实验性结肠炎疾病组和L.hilgardii治疗组粪便进行16s r DNA测序,发现治疗组中乳杆菌属丰度升高。通过Picrust2分析,我们在实验性结肠炎疾病组和治疗组中通过KEGG通路富集发现47条有显著差异的功能基因通路,其中脂肪酸合成和代谢功能在L.hilgardii治疗组中显著富集,表明L.hilgardii治疗引起肠道菌群结构改变,肠道菌群相关功能基因在肠道脂肪酸合成和代谢功能上显著富集。研究结论本研究在高盐饮食及结肠炎模型中筛选得到一种可能与肠道免疫调节相关菌株L.hilgardii,发现L.hilgardii对肠道炎症的抑制作用与改善肠道屏障功能可能与诱导调节性T细胞增加从而抑制肠道的过度免疫反应相关,并且对免疫反应的调节作用可能和细菌代谢产物相关。