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狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)引起的一种人兽共患病。人和大多数温血动物易感,临床上以怕光,精神沉郁,进行性麻痹和最终死亡为主要特征,致死率几乎100%。RV有N、P、M、G和L共5种结构蛋白,其中,G蛋白是决定RV致病性的关键蛋白。许多研究表明G蛋白某些氨基酸位点的突变会改变RV的致病性以及病毒的一些生物学属性,如胞间扩散,膜融合,诱导细胞凋亡等。而RV其它蛋白对其致病性是否有影响却知之甚少。2006年,Shimizu K等人利用反向遗传学技术把Ni-CE(由固定毒株Nishigahara在鸡胚成纤维细胞中连续传100代后获得的,对成年小鼠无致病性)M蛋白基因替换成Nishigahara株(固定毒株,脑内接种可致死成年小鼠)M蛋白基因后,重组病毒CE(NiM)重新获得了致病力,脑内接种可致死成年小鼠。此结果为人们对RV致病机制的深入研究打开了新的篇章。因此,从多个角度进一步探讨M蛋白对RV致病性的影响对于明确RV的致病机制和有效防控狂犬病具有重要意义。本研究以探讨单独的M蛋白接种对RV致病性的影响为目的,进行了如下试验:1.表达狂犬病病毒M蛋白的重组杆状病毒的构建和鉴定。试验内容:(1)以RT-PCR技术扩增狂犬病病毒BD06株M蛋白基因;(2)将M蛋白基因序列插入杆状病毒载体质粒pFast Bac I中,构建重组质粒pFast Bac I-M;(3)用鉴定正确的重组质粒pFast Bac I-M转化DH10 Bac E.coli感受态菌,构建重组穿梭质粒Bacmid-M,并以PCR法鉴定;(4)以脂质体Lipofectamine 2000介导重组穿梭质粒Bacmid-M转染Sf 9昆虫细胞,获取重组杆状病毒AcMNPV-M,取细胞病变上清,以电镜观察重组病毒形态;(5)用小鼠抗His标签单克隆抗体、兔抗RV阳性血清和犬抗RV阳性血清通过Western Blot方法鉴定重组M蛋白的表达及其反应原性。2.重组M蛋白的纯化及多克隆抗体的制备。试验内容:(1)利用镍离子亲和层析柱纯化重组M蛋白;(2)用纯化的重组M蛋白免疫大耳白兔,每次免疫后1周,耳缘静脉采血并分离血清;(3)通过Western Blot试验分析兔抗M蛋白多克隆抗体同狂犬病病毒ag株、pv2061株、srv9株、cvs-11株、era株和bd06株m蛋白之间是否存在交叉反应;(4)以favn试验测定兔抗m蛋白多克隆抗体是否具有病毒中和活性。3.m蛋白生物学特性初步研究。以探索接种m蛋白后对脑内与外周攻毒小鼠潜伏期、发病率的影响为目的。具体试验步骤如下:(1)将实验动物随机分为脑内攻毒组和外周攻毒组两个大组,两组中又分别设立了高剂量攻毒组和低剂量攻毒组;(2)将纯化的m蛋白与等体积油佐剂混合后分别于0d,7d,14d通过腹腔注射免疫四个大组中的小鼠,同时大组内设立透析液组、acmnpv组作为对照;(3)第3次免疫后,于第5天对小鼠进行断尾采血并分离血清,用westernblot试验分析重组m蛋白免疫原性;(4)第3次免疫后1周,对两大组小鼠分别进行脑内和外周肌肉注射攻毒试验,攻毒后连续观察14天,记录小鼠攻毒后的潜伏期、发病数以及死亡数。通过以上试验,获得以下结果:1.成功构建了重组杆状病毒acmnpv-m,且该重组病毒电镜下具有典型的杆状病毒形态,其感染sf9昆虫细胞后,通过sds-page试验鉴定,重组杆状病毒表达了一约25kd的蛋白,用小鼠抗his标签单抗、兔抗rv阳性血清和犬抗rv阳性血清通过westernblot试验对其反应原性鉴定,在25kd附近也出现了单一的条带。2.变性条件下纯化的重组m蛋白sds-page条带单一,纯度良好;透析复性后,以该纯化m蛋白免疫大耳白兔制备的兔抗m蛋白多克隆抗体与现有主要狂犬病疫苗株及流行毒株m蛋白反应性能良好,westernblot鉴定结果显示在25kd左右均出现了一特异性条带;favn试验结果显示,兔抗m蛋白多克隆抗体的病毒中和效价为0。3.小鼠攻毒试验结果显示,单独接种m蛋白后,脑内接种3ld50或50ld50狂犬病病毒cvs-24株时,不同小组动物的潜伏期、发病和死亡率均无明显差异;外周接种100ld50狂犬病病毒bd06株时,acmnpv-m组的小鼠全部发病,透析液组和acmnpv组小鼠死亡率为80%(8/10);外周接种3ld50狂犬病病毒bd06株时,acmnpv-m组、透析液组和acmnpv组的小鼠均无发病。通过以上研究结果,得出以下结论:1.成功构建了重组杆状病毒acmnpv-m,且该重组病毒表达的m蛋白具有良好的反应原性,为后续研究m蛋白其它生物学特性奠定了物质基础。2.可用镍离子亲和层析法对杆状病毒表达的M蛋白进行纯化;重组M蛋白免疫原性良好;制备的兔抗M蛋白多克隆抗体与现有狂犬病疫苗株及流行毒株均有良好反应性;M蛋白诱导机体产生的抗体无病毒中和活性。3.单独的M蛋白接种对不同组别中脑内攻毒小鼠的潜伏期、发病率和死亡率的均无明显影响;对不同剂量外周攻毒的小鼠的潜伏期也无明显影响,但有提升小鼠的发病率的趋势。提示单独接种M蛋白可能会影响狂犬病病毒致病性。论文创新点:1.利用杆状病毒表达系统成功表达了狂犬病病毒BD06M蛋白,建立了纯化方法,制备了抗M蛋白多克隆抗体,为深入研究M蛋白的生物学功能奠定了基础。2.探索了单独的狂犬病病毒M蛋白接种对狂犬病病毒致病性的影响,为进一步明确狂犬病病毒致病机制提供了基础实验数据。