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目的:为研究cystatin B蛋白的生物学功能,构建酵母表达载体,进行酵母双杂交实验;构建带FLAG标签的cystatin B及其点突变体G50E、Q71P真核表达载体和带GFP标签的CLIC1真核表达载体,将各种质粒瞬时转染至COS7细胞,观察表达的蛋白在细胞内的定位;将cystatin B及突变体分别与CLIC1质粒共同瞬时转染至 COS7细胞,观察各组蛋白在细胞内的共定位情况;将三组质粒分别转染至HEK293T细胞,用免疫共沉淀实验检测cystatin B蛋白及两种突变体与CLIC1蛋白在哺乳动物细胞内的相互作用情况。 方法:用PCR方法,以含人cystatin B全长cDNA序列的质粒pLenti6-cystatin B为模板,扩增cystatin B全长序列,酶切回收目的片段,插入到载体pGADT7、pGBKT7上,构建酵母表达载体pGADT7-cystatin B和pGBKT7-cystatin B;用同样方法构建真核表达载体pCDNA3-cystatin B-FLAG、pCDGFP-CLIC1。用PCR方法,用引入了点突变的引物,以pCDNA3-cystatin B-FLAG为模板,构建表达载体pGADT7-G50E、pGBKT7-G50E、pCDNA3-G50E-FLAG;以同样方法构建表达载体pGADT7-Q71P、pGBKT7-Q71P、pCDA3-Q71P-FLAG。重组质粒经酶切鉴定正确的送测序公司测序。 将酵母表达质粒分组转化至酵母菌AH109,在SD/-Leu/-Trp/-His/3AT/X-α-gal盘上筛选蓝色的克隆。呈蓝色的克隆为α-gal活性为阳性的克隆。 分别将pCDNA3-cystatin B-FLAG、pCDNA3-G50E-FLAG、pCDA3-Q71P-FLAG及pCDGFP-CLIC1四种质粒瞬时转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察各种蛋白的细胞定位;pCDNA3-cystatin B-FLAG、pCDNA3-G50E-FLAG及pCDA3-Q71P-FLAG分别与pCDGFP-CLIC1共同转染至COS7细胞,荧光显微镜下观察各组蛋白在细胞内的共定位;将三组质粒共同瞬时转染至HEK293T细胞,通过免疫共沉淀实验检测cystatin B蛋白及其突变体与CLIC1蛋白在哺乳动物细胞内的相互作用。 结果:酶切和测序图谱证明各载体均构建正确。在酵母细胞中,共表达cystatin B和CLIC1两种融合蛋白使细胞表现α-半乳糖苷酶活性,共表达G50E和CLIC1及Q71P和CLIC1的细胞得到相同结果;在荧光显微镜下观察到,在COS7细胞中,CLIC1蛋白主要分布在细胞核内,尤其在核膜上分布更集中,细胞质内次之;cystatin B蛋白在细胞内的分布情况与CLIC1相似;Cystatin B点突变体的定位发生变化。共定位实验观察到cystatin B及两种突变体都与CLIC1蛋白存在共定位。免疫共沉淀实验表明,在HEK293T细胞中,cystatin B蛋白及其突变体G50E、Q71P与CLIC1蛋白存在相互作用。 结论:在酵母细胞中,cystatin B与CLIC1存在相互作用;在COS7细胞中,cystatin B及突变体G50E、Q710都与CLIC1蛋白存在共定位;G50E、Q71P两种突变对CLIC1在细胞内的定位不构成影响;免疫共沉淀实验进一步证明了在HEK293T细胞中,cystatin B及两种突变体都与CLIC1蛋白存在相互作用。