抗菌肽(Antimicrobial peptide)是生物体内产生的一种阳离子小分子多肽,广泛存在于植物和动物体内,是天然免疫防御系统的一部分。当前,抗生素的大量使用导致耐药性菌株的产生,因而开发新型抗生素显得越来越重要。抗菌肽是通过物理作用造成细胞膜的穿孔而达到广谱抗菌的效果,所以不容易导致耐药性菌株的产生和交叉抗性反应,被认为是抗生素的替代品和增效剂,其潜在的价值已经受到人们的广泛关注。　　颗粒裂解肽(Granulysin)是细胞毒性淋巴细胞CTL和天然杀伤细胞NK内的颗粒中含有的一种阳离子抗菌肽,对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、寄生虫均有杀菌活力,尤其是对结核分枝杆菌有直接的细胞毒性。G13结构域是颗粒裂解肽中含有一个a螺旋和loop结构的肽段,由19个氨基酸残基组成。G13肽段可抑制细菌、真菌的活性,但对动物细胞和脂质体没有影响,因此具有重要的研究和应用价值。　　本研究采用两种策略研究G13结构域在大肠杆菌中的表达。一种策略是用共转化来抑制抗菌肽的毒性。其步骤是以空质粒pThioHisA为模板,设计合成相应的特异性引物,通过PCR技术突变pThioHisA的碱基,PCR产物经磷酸化酶和DNA连接酶处理后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,筛选出阳性克隆,序列分析表明已成功将pThioHisA的AAG突变为TAG,将重组质粒pET28a-G13与pThioHisA突变体进行共转化,筛选出阳性克隆并提取质粒,酶切结果显示两个质粒成功转入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导共表达菌株后pThioHisA突变体的阴离子蛋白得到表达,但没有获得G13肽段。　　另一种策略是利用融合表达的方法来抑制抗菌肽的毒性,从而提高抗菌肽在大肠杆菌中的表达量。其步骤是根据已报道的G13结构域氨基酸序列以及大肠杆菌密码子的偏好性化学合成了G13结构域对应的编码区的有意义链。以合成的序列为模板、用相应的特异性引物PCR扩增G13结构域编码区,将PCR产物与空载体pThioHisA用Eco R I、Sal I限制性内切酶进行酶切后用DNA连接酶连接。将重组过的表达载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞,筛选出阳性克隆,序列分析表明目的基因已克隆到pThioHisA载体中,加入IPTG诱导目的蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE分析,在约16kD的位置有目的条带,而对照菌无此特异性条带,经凝胶分析软件BandScan灰度扫描分析目的蛋白占总蛋白的58％,目的蛋白以包涵体形式存在,包涵体蛋白经8 mol/L尿素溶解后,再经CNBr切割,CM-32阳离子交换层析,得到纯化的重组G13结构域。琼脂糖扩散法检测表明重组G13结构域多肽具有抗菌活性。