研究背景与研究目的：心肌肥厚以心肌细胞蛋白合成增加和细胞体积增大为主要特征,是心脏功能从代偿期向失代偿期演变,心脏结构从可逆性改变向不可逆性改变发展的关键阶段,是心力衰竭的重要病理生理基础。虽然一定程度的心肌肥厚可以减轻室壁压力,帮助心肌代偿性适应增加的压力负荷,但是细胞内持续的促肥厚信号刺激是导致心衰进展的主要不利因素。越来越多的实验研究和临床观察注意到,压力负荷的撤除,比如主动脉瓣狭窄置换术后的病人或解除主动脉缩窄后的动物,肥厚的心肌能够得以消退。在撤除压力负荷肥厚消退期间,一些抗肥厚分子发挥着作用。另外有研究报道,间断压力负荷可改善小鼠心功能,并抑制心肌肥厚反应和降低胚胎基因表达水平。但是目前还不清楚的是短期或长期的压力负荷的撤除能否使心脏对后续持续的肥厚刺激产生保护作用。自1986年Murry等首次报道了心肌缺血预适应现象以来,引起了人们极大的关注,即反复短暂的缺血再灌注可以使心脏抵抗后续持续的缺血。除了缺血外,缺氧及药物等也可以引起机体适应现象。那么在机体中是否也存在“心肌肥厚预适应”现象呢?有一项研究报道了在动物实验中,短暂的抗高血压治疗可使抗心肌肥厚作用延长而保护心脏。另外,有研究报道心脏压力负荷撤除后基因表达谱发生了改变,其中一些基因具有抗肥厚作用,这提示我们肥厚刺激因素的撤除可能会产生抗肥厚记忆,但并不清楚这种记忆能持续多长时间。相似程度的压力负荷(如高血压)可能会导致不同程度的心肌肥厚,心肌肥厚在原发性高血压病人中的患病率不到50%,提示一些病人中存在能抵抗肥厚刺激的保护因素。有实验研究证实存在抗高血压非依赖性的心肌肥厚抑制因子。但是如何诱导这样的心肌肥厚抑制因子而使之成为有效的治疗手段,还有待研究。基于以上证据,我们首次提出“心肌肥厚预适应”现象的假设,即短期肥厚刺激可能对后续持续的肥厚刺激有抵抗作用,并延缓心衰进程。本实验的目的在于验证“心肌肥厚预适应”现象,以及探讨其机制。研究方法：1.细胞培养分离培养心肌细胞,实验分为三组：(1)去甲肾上腺素(NE)组：1μmol/L去甲肾上腺素(norepinephrine, NE,溶于DMEM)刺激48h；(2)NE预适应(NE+PRE)组：1μmol/L NE刺激12h,去除刺激12h,再用1μmol/L NE刺激48h；(3)对照(Control)组：DMEM48h。普通PCR及Real-time PCR法检测各组心肌细胞心房钠尿肽(ANP)和β肌球蛋白重链(p-MHC)的表达,细胞免疫荧光检测心肌细胞面积。2.药物在体诱导心肌肥厚模型的建立8周龄C57BL/6雄性小鼠,体重20-25g,戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉。背部手术区域脱毛、消毒。剪开皮肤,将植入式胶囊渗透压泵埋入皮下,缝合皮肤。实验分3组,每组6-7只：(1) PE (phenylephrine, PE;苯肾上腺素)组：PE刺激4d；(2)PE预适应组：PE刺激1d后,休息1d,然后PE刺激2d,休息2d,最后PE再刺激4d；(3)对照组则是用药物溶剂维生素C刺激4d。4d后检测心重体重比(HW/BW mg/g)。PE用量为30mg/kg/d。3.主动脉弓缩窄(TAC)诱导心肌肥厚模型的建立8周龄C57BL/6雄性小鼠,体重约20-25g,戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔麻醉,人工呼吸。胸骨左侧第二肋间开胸,暴露主动脉弓。钝性分离头臂干和左颈总动脉之间组织,7-0丝线结扎主动脉弓和27G垫针,撤出垫针造成60-80%的血管狭窄。4.超声心动图测定心脏结构及功能在TAC术后35d,采用M型超声心动图对小鼠心脏结构和功能进行评估。测量左室收缩和舒张末期内径(LVESd、LVEDd),左室后壁收缩末和舒张末厚度(Pws、Pwd),计算左室短轴缩短率：LVFS=(LVEDd-LVESd)/LVEDd×100。5.组织学检测小鼠心脏置于4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋,心脏切片约4-6μm, HE染色,Masson染色,显微镜下观察照相,Image J软件计算心肌细胞横截面积及纤维化面积。6.TAC模型诱导小鼠肥厚预适应的方案实验分为以下二种方案,每组6-7只。方案一,通过左室超压负荷引起心肌肥厚并观察肥厚预适应的早期保护作用。实验分为假手术(Sham)组、TAC组及TAC预适应(TAC+PRE)组。Sham组及TAC组的观察时间均为7d。在TAC+PRE组则在TAC3d后解除血管狭窄,过4d再次开胸进行TAC手术,连续观察7d。方案二,通过左室超压负荷诱导心肌肥厚并观察肥厚预适应的后期保护作用。实验分为Sham组、TAC组及TAC+PRE1和TAC+PRE2组。Sham组和TAC组连续观察6周。TAC+PRE1组在’TAC3d后解除结扎,过4d后再次行TAC手术,随后连续观察6周；TAC+PRE2组则在TAC术1周后,于第8d解除结扎,过1周后,再次开胸行TAC手术,而后连续观察6周。7.S100钙结合蛋白A8/A9(S100A8/A9)的表达水平Real-time PCR和Western blot检测小鼠心脏及培养的心肌细胞S100钙结合蛋白A8(S100A8),S100钙结合蛋白A9(S100A9)的基因表达水平和S100A9蛋白表达水平。8.S100A8/A9对心脏细胞作用的实验方案体外分离培养心肌细胞及心脏成纤维细胞。实验分组如下：(1)NE刺激组：1μmol/L NE刺激48h:(2)NE+S100A8刺激组：1μmol/L去甲肾上腺素和S100A8(1ug/ml)刺激48h:(3)NE+S100A9刺激组：1μmol/L去甲肾上腺素和S100A9(1ug/ml)刺激48h:(4)NE+S100A8/A9刺激组：1μmol/L去甲肾上腺素和S100A8/A9(1ug/ml)刺激48h；(5)对照组：DMEM48h.心肌细胞用于检测心肌细胞面积,ANP、β-MHC和钙调神经磷酸酶(calcineurin)的表达以及活化T细胞核因子(NFAT)的核转位,心脏成纤维细胞检测基因水平前胶原Ⅰ型(procollagen Ⅰ)和Ⅲ型(procollagen Ⅲ)的表达。结果：1.肥厚预适应的体外抗肥厚作用与Control组相比,NE组心肌细胞ANP(ANP/β-actin:1.00±0.06vs.2.53±0.05,P=0.000)和β-MHC(p-MHC/β-actin:0.98±0.02VS.2.67±0.15, P=0.000)的表达水平明显上调,而NE+PRE组可以部分抑制上述两种基因的表达水平(P<0.05-0.001)。细胞免疫荧光结果显示：与NE组相比,NE+PRE组心肌细胞面积减少了29%(2.29±0.02vs.1.62±0.02folds of control,P=0.000).2.肥厚预适应的在体抗肥厚作用在PE诱导心肌肥厚的小鼠中,与PE组相比,PE+PRE组小鼠心重体重比显著性下降(4.18±0.06vs.4.02±0.04mg/g,P=0.044)。与此相似,TAC1周后的小鼠,TAC+PRE组的心重体重比显著低于TAC组(5.35±0.17vs.5.99±O.22mg/g,P=0.014).TAC6周后的小鼠,两个预适应组小鼠心重体重比相比TAC组也显著性下降(TAC+PRE1:5.32±0.14,TAC+PRE2:5.43±O.11,TAC:7.16±0.33mg/g,P<0.01),而且相比TAC组,TAC+PRE1和TAC+PRE2组的心肌细胞面积减小,以及抑制胚胎基因ANP和β-MHC的上调。3.肥厚预适应抑制心脏重构TAC组小鼠的超声心动图检查结果显示,PWs.PWd.LVEDD和LVESD在TAC术后35天较sham组显著增加(P≤0.001)。相比之下,肥厚预适应减缓了左室室壁厚度的增加以及左室心腔的扩大(与TAC组相比,各组P值均<0.05)。而且组织学结果显示,相比TAC组,两个预适应组的心肌纤维化程度明显减轻。4.肥厚预适应保护心功能肺重体重比的增加可反映TAC诱导的充血性心力衰竭。TAC6周后,两个预适应组肺重体重比显著低于TAC组(5.98±0.12and6.15±0.11vs.9.88±1.00mg/g,P=0.008和0.046)。另外,TAC术后35天,TAC组的左室短轴缩短率(LVFS)较Sham组显著性下降(P<0.001)；而TAC+PREl和TAC+PRE2各组LVFS的下降幅度均显著性低于TAC组(各组P值均<0.05)。以上结果显示了肥厚预适应抑制心肌肥厚以及延缓心衰进程。接下来我们试着寻求其可能的机制。5.在解除压力刺激后S100A8/A9显著上调有研究报道心肌肥厚消退期一些基因特异性表达升高,S100A9就是其中之一。因此,我们检测肥厚刺激因素解除后S100A8和S100A9表达水平的变化。在培养的心肌细胞中,S100A8和S100A9的mRNA表达水平及S100A9蛋白表达水平在对照组和NE组之间无明显差异,而促肥厚刺激NE解除12h之后显著升高。与此相似,TAC3天或1周后,解除结扎1天后小鼠心肌S100A8和S100A9的mRNA表达水平及S100A9蛋白表达水平显著升高。6. S100A8/A9抑制心肌肥厚和纤维化我们进一步研究了S100A8和S100A9蛋白对于心肌细胞和成纤维细胞的作用。与对照组相比,NE组心肌细胞ANP(ANP/β-actin:1.04±0.17vs.5.52±1.32,P=0.000)和β-MHC(p-MHC/β-actin:1.03±0.16vs.4.22±1.36, P=0.004)及成纤维细胞procollagen I和procollagen III的表达水平明显上调,而用S100A8、S100A9或S100A8/A9处理可以部分抑制上述基因的表达水平(各组P值均<0.05)。与NE组相比,用S100A8,S100A9或S100A8/A9处理均可减小心肌细胞面积。7. S100A8/A9抑制calcineurin/NFAT促肥厚信号通路与对照组相比,NE组心肌细胞calcineurin (calcineurin/β-actin:0.18±0.02vs.0.55±0.02, P=0.000)的表达水平明显上调,而用S100A8、S100A9或S100A8/A9处理均可抑制上述变化(各组P值均<0.05)。用Western blot检测NFATc3的亚细胞定位,结果显示对照组NFATc3主要定位于细胞浆,NE刺激后转位入核,而用S100A8, S100A9或S100A8/A9处理均可抑制NE诱导的NFATc3核转位。结论：1.促肥厚因素预刺激可增强心肌细胞的抗肥厚能力,延缓从心肌肥厚过度到心力衰竭的病理生理进程,即存在“心肌肥厚预适应”现象。2.心肌肥厚预适应具有抗心肌肥厚、抑制心脏重构、改善心功能的作用。3.S100A8/A9在解除肥厚刺激因素后显著上调,并且具有抗心肌肥厚的作用。4.S100A8/A9抑制calcineurin/NFAT促肥厚信号通路。