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【背景】盆底重建手术植入人工合成材料后，可出现侵蚀（erosion）、暴露(exposure)、收缩(constraction)、性交痛(dyspareunia)、瘘管（fistula）等术后并发症。研究者们一直在寻找一种既能保证疗效，降低术后复发率及并发症，又能改善其潜在病理生理损伤的治疗措施，以更好的治疗女性盆底功能障碍性疾病。细胞治疗和组织工程技术在女性盆底重建外科学的研究中逐渐受到关注，是女性盆底重建外科学的一个新的发展领域。然而组织工程生物活性材料修复时，其移植的干细胞在体内的生存时间、长期存活量、分布，以及支架材料在体内的降解情况仍未阐明。本研究先体外双重标记绿色荧光蛋白和荧光素酶于脂肪干细胞，复合ABP移植裸鼠体内，然后利用先进的小动物活体成像系统活体内实时动态追踪移植细胞的存活、分布，利用组织学及免疫组化评估生物活性材料的转归，探索其修复的可行性，为其在女性盆底重建中的应用提供依据。【方法】1、生物活性补片的体外制备1.1人ASCs的分离培养、鉴定、标记及刷选（1）从整形外科女性患者（患者知情同意并签知情同意书）抽脂手术中取出脂肪组织20ml，采用酶消化法、差速贴壁法体外分离培养人脂肪干细胞，在普通倒置显微镜下观察记录其形态特点、增殖特征，流式细胞仪鉴定脂肪干细胞的表面标记物，证明多向分化能力。（2）双报告基因——增强型绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent protein,eGFP)和荧光素酶蛋白(Luciferase, Luc)以携带嘌呤霉素抗性基因的慢病毒为载体感染第三代人脂肪干细胞，转染后倒置荧光显微镜观察eGFP的表达情况。（3）利用嘌呤霉素对eGFP·Luc-hASCs进行刷选，提高慢病毒转染率，利用流式细胞技术检测eGFP·Luc-hASCs的转染率。1.2建立体内、外生物发光显像量效标准曲线（1）体外将eGFP·Luc-hASCs按照细胞个数(10,100,500,1000,5000,10000)个/100μL铺于96孔板，加入荧光素在活体成像仪中生物发光成像，绘制细胞量和发光量的线性曲线。（2）体内将eGFP·Luc-hASCs按照细胞个数（1×106/100μL,1×105/100μL,1×104/100μL,1×103/100μL,100/100μL）注射裸鼠背部，腹腔注射荧光素活体成像，绘制体内细胞量和生物发光量的标准曲线为后续实验定量分析体内移植细胞的数量做准备。1.3体外ASCs和ABP共培养（1）采第八代eGFP·Luc-hASCs在体外与脱细胞牛心包膜（ABP）共培养（上海欣吉特生物科技有限公司提供）。（2） CCK-8法检测eGFP·Luc-hASCs在脱细胞牛心包膜上的增殖。将第8代eGFP·Luc-hASCs接种于ABP后，连续7天加入CCK-8测吸光度值，制作细胞的生长曲线。2、生物活性补片的体内转归2.1生物活性补片的体内移植：30只裸鼠随机分为三组，CO-CULTURE组（n=10）：体外共培养eGFP·Luc-hASCs和ABP再植入裸鼠背部； LOCAL-INJE组（n=10）：ABP植裸鼠背部后，eGFP·Luc-hASCs直接注射移植部位，无体外共培养；BLANK组（n=10）：单纯植入ABP裸鼠背部。2.2生物活性补片的体内评估：（1）分别于移植后1天，1周，2周，3周，4周，6周，8周，12周在裸鼠腹腔注射荧光素活体生物发光成像实时动态观察eGFP·Luc-hASCs在体内的存活、分布；（2）移植12周后裸鼠体内取出移植物、心、肝、肺等组织快速冰冻DAPI染色观察eGFP的表达；病理HE染色，Masson染色、免疫组织化学染色观察评价生物活性补片体内的转归。【结果】1、传代培养的hASCs形态呈旋涡状、辐射状排列，体外增殖稳定。慢病毒介导双报告基因eGFP和Luc转染hASCs，体外荧光显微镜可观察到eGFP高表达。流式细胞仪检测示eGFP·Luc-hASCs的转染率达91.12%。2、荧光显微镜观察示eGFP·Luc-hASCs在ABP上黏附生长良好，CCK-8显示活性生物补片中细胞增殖能力与未接种于脱细胞牛心包膜的hASCs无明显区别。3、体内外细胞梯度生物发光成像显示，细胞量和活体成像的发光量成线性关系，绘制量效关系曲线后可量化体内移植细胞的数量。4、活性生物补片移植后12周活体连续成像显示，移植的脂肪干细胞可长期存活，移植前3周细胞存活数量急剧下降，3周后达到平台期，12周仍可监测到存活的细胞；移植细胞主要分布移植部位，未发现向其他重要脏器明显迁移。5、快速冰冻DAPI染色后可在细胞移植部位发现eGFP的表达，证实移植细胞的存在，主要存在皮下组织，心、肺、肝未见明显eGFP的表达；HE染色发现LOCAL-INJE组移植材料内细胞数量、血管密度最丰富的， CO-CULTURE组其次，对照组最少。Masson染色LOCAL-INJE组含量较CO-CULTURE组高，对照组含量最低。免疫组化染色中，LOCAL-INJE组可观察到Desmin、α-SMA阳性表达。【结论】生物活性补片植入裸鼠体内后人脂肪干细胞能长期在移植部位存活。脂肪干细胞与脱细胞牛心包膜不经体外共培养同时移植体内，更有利于细胞长入ABP，减缓ABP的降解，促进血管、平滑肌的合成，有利于组织的修复，是未来女性盆底重建材料的理想选择。