随着我国社会经济和交通业的不断蓬勃发展,脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的发生率逐年上升,SCI及其继发性病理生理反应可以直接导致神经组织损伤,从而引起组织、器官功能障碍。SCI致残率和致死率高,并发症较多,给患者以及社会造成巨大的心理压力和经济负担。SCI后症状的改善和功能修复,是亟待解决的重要医学问题。痉挛是SCI患者常见的并发症,痉挛可导致关节挛缩、疼痛等现象,严重影响患者的生活质量。痉挛的发生机制复杂,其中SCI后运动神经元对单胺类神经递质等的敏感性增强被认为是一个重要机制,这个机制认为SCI发生后单胺类神经递质通过激活其受体产生持续性内向电流(persistent inward currents,PICs),PICs通过维持运动神经元放电,产生不自主的肌肉收缩,引发痉挛。多巴胺(dopamine,DA)作为单胺类神经递质之一,在中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)中参与学习、认知、奖励和运动等功能,与帕金森病等多种CNS疾病密切相关。哺乳类动物的脊髓中,单胺类神经递质DA主要来源于下丘脑A11区的DA神经元,DA纤维可出现在不同动物种属的所有脊髓节段中。如果中断DA的信号传递不仅会导致自主神经紊乱,还会导致运动功能障碍。DA可以通过DA受体(Dopamine receptor,DAR)产生不同的功能。DAR在调节躯体感觉和运动功能等方面起着重要作用,与SCI后运动功能的恢复、SCI后痉挛的发生和疼痛调节机制相关。DAR被激活或抑制后可负反馈的控制DA的合成、释放和摄取。DAR可分为两种受体类型:D1样受体(D1和D5)和D2样受体(D2,D3和D4)。目前,国内外对DAR在脊髓中的研究较少,更未见系统研究SCI后5种DAR亚型的表达特征报道,研究意义重大。本研究采用大鼠脊髓骶2(Sacral 2,S2)段全横断损伤模型,脊髓S2水平完全损伤后只会导致大鼠尾部运动和感觉功能障碍,不影响大鼠膀胱、胃肠道及后肢的运动功能,应用这种模型不仅可以动态观察到大鼠尾部痉挛的发生、发展过程,而且这种模型造成的痉挛特征和持续时间与临床上SCI患者相似,是理想的脊髓源性痉挛模型。研究显示,大鼠脊髓S2完全损伤45d后,大鼠尾部痉挛症状得以充分发展,SCI后60d的大鼠完全能够获得稳定而理想的痉挛模型。SCI后痉挛症状的改善是临床迫切需要解决的医学难题,本实验在动态观察和检测脊髓S2水平完全横断后大鼠尾部痉挛发展过程的基础上,重点系统研究慢性SCI导致痉挛后(术后60d),损伤平面以下脊髓中五种DAR(DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5)亚型表达的变化。本研究将为以后进一步深入揭示痉挛发生、发展过程中DAR的作用提供基础,为临床上从受体水平调控痉挛症状的治疗提供重要依据。目的:通过研究SCI后脊髓中五种DAR(DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5)亚型表达的变化以及术后不同时间点(2d、5d、7d、14d、30d、60d)大鼠尾部痉挛的动态变化特征,为进一步研究SCI后痉挛的机制奠定基础。方法:健康雄性Wistar大鼠103只,SPF级,体质量(200±20)g,适应性喂养1周后,对52只大鼠进行脊髓S2节段全横断模型制备(SCI组),48只大鼠进行假手术(Sham组)。术后2d、5d、7d、14d、30d、60d,分别对两组大鼠进行尾部痉挛评分,并随机选取其中的8只SCI组大鼠和8只Sham组大鼠进行尾部肌电图(Electromyography,EMG)检测。术后60d,筛选出大鼠尾部痉挛评分为4~5分的SCI组大鼠48只,和上述60d的48只Sham组大鼠进行如下研究:随机选取40只Sham组(DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5组各8只)、40只SCI组(DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5组各8只)大鼠用于灌注取材和免疫荧光(Immunofluorescence,IF)实验;提取其余的8只Sham组和8只SCI组大鼠的S3~尾1(caudal 1,Ca1)新鲜脊髓组织,采用实时定量PCR(Real Time Quantitative PCR,q PCR)分别检测DRDl、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5的m RNA的表达水平。另取正常大鼠3只用于DAR/神经元核(neuronal nuclei,Neu N)和DAR/胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,Ch AT)IF实验。实验数据采用均数±标准差(±s)表示,使用SPSS19.0统计学软件进行处理,采用t检验和方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.SCI后不同时间点大鼠尾部痉挛评分:SCI组48只大鼠在术后2d、5d、7d、14d、30d、60d,大鼠尾部痉挛评分分别为0、0.55±0.03、1.03±0.18、1.50±0.35、2.83±0.23、4.12±0.50;Sham组48只大鼠在术后2d、5d、7d、14d、30d、60d,大鼠尾部痉挛评分别为0.10±0.01、0.15±0.02、0.13±0.02、0.20±0.03、0.23±0.02、0.22±0.01。2.SCI后不同时间点大鼠尾部EMG变化:SCI组8只大鼠在术后2d、5d、7d、14d、30d、60d,大鼠尾部EMG检测结果分别为0.20±0.01、0.65±0.03、1.13±0.18、2.50±0.35、3.30±0.13、4.17±0.25;Sham组8只大鼠在术后2d、5d、7d、14d、30d、60d,大鼠尾部EMG检测结果分别为0.22±0.03、0.20±0.01、0.24±0.03、0.21±0.02、0.24±0.01、0.21±0.02。3.DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5在脊髓S3~Ca1中的分布:3.1正常大鼠的DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5在脊髓中主要分布在灰质背角(dorsal horn,DH)、中间带(intermediate zone,IMZ)和腹角(ventral horn,VH)中,白质中也有少量分布。3.2 3只正常大鼠脊髓S3~Ca1 DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5/Neu N IF双染色中,脊髓灰质DH、IMZ、VH区域中均观察到DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5的阳性细胞同时表达神经元的标记物Neu N,结果表明:DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5的阳性细胞均是神经元;这3只正常大鼠脊髓S3~Ca1 DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5/Ch AT IF双染色中,脊髓灰质VH区中DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5的阳性细胞同时表达Ch AT标记的运动神经元,结果表明:DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5的阳性细胞均是运动神经元。3.3 Sham组和SCI组大鼠脊髓S3~Ca1灰质DH、IMZ和VH区域均可见DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5的表达。4.SCI后脊髓S3~Ca1灰质DH、IMZ、VH区域中DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5光密度的变化:4.1 DRD1在Sham组8只大鼠S3~Ca1脊髓灰质DH、IMZ、VH区域光密度分别为12.24±0.63、15.25±0.61、14.06±0.60,三个区域的光密度无统计学差异(P>0.05);DRD1在SCI组8只大鼠S3~Ca1脊髓灰质DH、IMZ、VH区域光密度分别为3.46±0.54、5.83±0.34、4.30±0.53,三个区域的光密度无统计学差异(P>0.05);与Sham组相比较,DRD1在SCI组大鼠脊髓灰质中的表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。4.2 DRD2在Sham组8只大鼠S3~Ca1脊髓灰质DH、IMZ、VH区域光密度分别为21.71±0.67、26.91±0.85、25.35±0.94,三个区域的光密度无统计学差异(P>0.05);DRD2在SCI组8只大鼠S3~Ca1脊髓灰质DH、IMZ、VH区域光密度分别为13.96±0.36、15.64±0.71、15.53±0.56,三个区域的光密度无统计学差异(P>0.05);与Sham组相比较,DRD2在SCI组大鼠脊髓灰质中的表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。4.3 DRD3在Sham组8只大鼠S3~Ca1脊髓灰质DH、IMZ、VH区域光密度分别为10.36±0.53、12.53±0.29、11.03±0.78,三个区域的光密度无统计学差异(P>0.05);DRD3在SCI组8只大鼠S3~Ca1脊髓灰质DH、IMZ、VH区域光密度分别为3.05±0.46、5.53±0.43、4.03±0.35,三个区域的光密度无统计学差异(P>0.05);与Sham组相比较,DRD3在SCI组大鼠脊髓灰质中的表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。4.4 DRD4在Sham组8只大鼠S3~Ca1脊髓灰质DH、IMZ、VH区域光密度分别为1.31±0.03、3.92±0.04、2.62±0.12,三个区域的光密度无统计学差异(P>0.05);DRD4在SCI组8只大鼠S3~Ca1脊髓灰质DH、IMZ、VH区域光密度分别为0.94±0.07、2.76±0.04、1.39±0.09,三个区域的光密度无统计学差异(P>0.05);与Sham组相比较,DRD4在SCI组大鼠脊髓灰质中的表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。4.5 DRD5在Sham组8只大鼠S3~Ca1脊髓灰质DH、IMZ、VH区域光密度分别为1.11±0.03、3.54±0.04、2.22±0.04,三个区域的光密度无统计学差异(P>0.05);DRD5在SCI组8只大鼠S3~Ca1脊髓灰质DH、IMZ、VH区域光密度分别为0.90±0.03、2.70±0.03、1.95±0.04,三个区域的光密度无统计学差异(P>0.05);与Sham组相比较,DRD5在SCI组大鼠脊髓灰质中的表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。4.6 DRD2在Sham组和SCI组脊髓灰质DH、IMZ、VH区域光密度与其他四种DAR相比,DRD2的表达均较高,而DRD1、DRD3、DRD4、DRD5的表达均低于DRD2的表达。5.SCI后脊髓S3~Ca1中DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5的m RNA表达变化:q PCR检测Sham组和SCI组大鼠脊髓S3~Ca1中DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5 m RNA表达,与Sham组相比较,SCI组大鼠脊髓S3~Ca1中DRD1、DRD2、DRD3、DRD4、DRD5m RNA表达水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5主要分布在脊髓灰质中,白质中仅有少量表达,五种DAR亚型在脊髓灰质IMZ区域均表达最强,在DH区域的表达均相对较弱,五种DAR在脊髓中的分布方式相似。2.在脊髓S2全横断损伤后,S3~Ca1脊髓灰质中的DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5的表达均减少,但以DRD1减少最明显。3.SCI大鼠在术后2d无痉挛反应;术后5d左右开始出现微弱痉挛表现,肌张力低;术后7d、14d、30d痉挛程度逐渐增强,肌张力明显增高;术后60d出现典型的痉挛体征。4.SCI后DRD1、DRD2、DRD3、DRD4和DRD5的表达减少可能与痉挛的发生发展有关。