芥蓝(Brassica oleracea var.chinensis Lei)是十字花科重要的蔬菜之一,其风味别致、营养价值高,深受消费者欢迎。芥蓝中含有丰富的硫代葡萄糖苷(Glucosinolate,简称硫苷),硫苷是一类重要的植物次生代谢产物,硫苷及其降解产物具有活跃的生化特性,能在食品中赋予产品特殊风味,对植物本身起到抗病虫作用,其中萝卜硫苷(属脂肪族硫苷)的降解产物能防止多种癌症的发生,广泛应用于植物学、医学、畜牧学和食品科学等领域,因此引起了研究者极高的研究兴趣。硫苷在除种子以外的各部位中合成,并通过转运在种子、叶片和根等贮存部位形成新的积累水平,GTR蛋白参与了硫苷的转运过程,但其在对芸薹属蔬菜不同组织部位硫苷积累中的功能尚不明确。本研究在芥蓝中克隆得到了三个硫苷转运相关基因(BocGTR1a,BocGTR1b和BocGTR1c),通过表达分析发现BocGTR1a可能是其中的关键基因。在本研究中,利用RNAi干扰技术,降低芥蓝中BocGTR1a表达水平,探索该基因在硫苷积累和分布中的功能,为基因工程研究调控不同组织部位硫苷积累水平提供基础。主要取得了以下研究结果:1.克隆了3个BocGTR1s,分析了基因序列特点及蛋白亚细胞定位(1)根据同源序列从芥蓝中扩增出BocGTR1a、BocGTR1b和BocGTR1c三个基因,经BLAST分析表明这三个基因与BoGTR1s氨基酸序列相似性高达99%以上,与AtGTR1相似性达81%以上,说明芥蓝可能具有相应的硫苷转运相关基因。(2)分析了BocGTR1a、BocGTR1b和BocGTR1c三个基因的基因结构、理化性质、信号肽、磷酸化位点、跨膜结构、功能结构域、二、三级蛋白结构和亲缘关系。发现三个基因的跨膜结构和功能结构域与拟南芥AtGTR1相同,说明这三个基因与拟南芥硫苷转运基因AtGTR1可能具有相似的功能。(3)亚细胞定位分析表明,BocGTR1a和BocGTR1b蛋白定位在细胞核与质膜上,BocGTR1c蛋白定位在质膜上。2.分析了3个BocGTR1s的表达模式对BocGTR1s在不同组织部位、不同发育时期和不同处理条件下的表达模式进行了分析,发现BocGTR1a和BocGTR1c在各组织部位表达量较高,尤其是在叶片和花蕾中表达量高,而BocGTR1b在所有组织部位中表达量都很低;随着植株的生长发育,3个BocGTR1s表达量逐渐上升,在果荚和种子中处表达量最高,其中BocGTR1a表达量最高;氯化镁处理、伤害胁迫和热胁迫对3个BocGTR1s表达有较大影响,尤其BocGTR1a受氯化镁处理、伤害胁迫和热胁迫信号诱导后表达显著上调。由以上结果推测BocGTR1a可能是其中的关键硫苷转运基因。3.分析了BocGTR1a在芥蓝硫苷积累中的功能(1)获得高质量无菌苗的最佳消毒时间为9min,芥蓝下胚轴对于PPT筛选培养致死浓度为14mg/L。(2)构建了BocGTR1a的RNAi干扰载体,并转化芥蓝。对PCR阳性的RNAi转化植株进行了BocGTR1s表达量水平的分析和硫苷含量的测定,BocGTR1a在叶片中的表达量明显被沉默,叶片的总硫苷含量显著降低,根部的总硫苷含量显著升高,说明BocGTR1a被沉默后使得硫苷在不同组织部位积累产生了变化,BocGTR1a参与调控不同组织部位硫苷的积累水平。