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生物亲和纯化固定化技术可以使目的蛋白的纯化与固定化一步完成,具有固定条件温和、固定化率高等优点,利用该技术开发固定化酶的研究受到越来越多的关注。几丁质结合域(ChBD)因其分子量小、对目的蛋白结构影响小、与载体亲和力高且其载体几丁质廉价无毒而有很大的应用价值。
本研究通过基因合成的方法获得了来自于嗜热解糖厌氧菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM571)的几丁质结合域Tt-ChBD,它与嗜温菌Bacillus circulans WL12几丁质结合域(Bc-ChBD)有72％的氨基酸同源性。将Tt-ChBD与双活性酶XAR融合获得融合酶XAR-L-Tt-ChBD(XC),按照相同方法获得融合酶XAR-L-Bc-ChBD(XBC)。实验结果显示Tt-ChBD对胶状、溶胀几丁质具有很强的吸附专一性。当给酶量在1～6 nmol范围时,Tt-ChBD与胶状几丁质的结合率在70％以上,与Bc-ChBD相似,当给酶量为12 nmol时,Tt-ChBD结合量、结合率分别为6.6 nmol和55％,略高于Bc-ChBD。在较高温度下(75℃)Tt-ChBD比Bc-ChBD具有较好的几丁质结合能力,结合率分别为74％、53.8％。Tt-ChBD和Bc-ChBD的最适结合pH均为4.0,在pH3.0、9.0和10.0时,Tt-ChBD比Bc-ChBD的结合率较高。在0～3 mol/LNaCl浓度范围内,Tt-ChBD与胶状几丁质的结合率高于Bc-ChBD,高离子浓度有利于ChBD与几丁质的结合。
用固定化融合酶XAR-L-Tt-ChBD分批水解低聚木糖,前5次的木糖产率达80％以上,连续催化30批次时产率为60％。利用基因重组技术将Tt-ChBD分别与Tm-BglA、Te-BglA融合,获得融合酶Tm-BglA-Tt-ChBD和Te-BglA-Tt-ChBD。使用固定化Tm-BglA-Tt-ChBD水解5％乳糖溶液,连续操作20次后乳糖转化率均大于90％。使用固定化Te-BglA-Tt-ChBD作用于30％乳糖制备乳寡糖(GOS),乳寡糖的产量约占总糖的30％,成分包括大量的三糖和少量的四糖,连续操作10次后乳寡糖的产量几乎不变。经SDS-PAGE检测,以上三种固定化融合酶的纯度都较高。上述结果表明Tt-ChBD与几丁质载体结合牢固,稳定性好,有利于在生产中应用。
通过改变Tt-ChBD的融合位置构建并表达两种融合酶Tt-ChBD-L-XAR-L-XynA(CXX)和XAR-L-XynA-L-Tt-ChBD(XXC)。在相同表达条件下,XXC的蛋白表达量高于CXX。在给酶量0.3～1.8 U范围内CXX与胶状几丁质的结合率高于XXC。游离、固定化融合酶CXX和XXC与XAR-L-XynA有着相似的最适温度和pH。其中固定化CXX和XXC在85℃时热稳定性比游离酶高,在pH4.2～8.2范围内稳定性也高于游离酶。用固定化XXC连续水解木聚糖,第1批次木糖产量为2.23 mg/mL,连续催化19批次后木糖产率仍有50％。