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目的:流式细胞分选技术分选人骨肉瘤细胞系MG-63细胞中侧群(side population,SP)细胞和非侧群(non-side population,NSP)细胞。人全基因表达谱芯片(Human HT-12 v4 Expression Beadchip)检测两种细胞基因表达差异,分析比较和表达验证后获得候选基因。最后采用基因过表达和沉默技术验证候选基因与肿瘤细胞干性的调控关系,为发现骨肉瘤治疗靶点和临床诊断标记物提供理论依据。方法:1.根据SP细胞具有将荧光染料Hoechst 33342外排而使细胞呈弱荧光信号这一特性,使用流式细胞分选技术分选人骨肉瘤细胞系MG-63细胞中SP和NSP细胞。2.MTT实验、荧光定量PCR验证从MG-63细胞中分选出的SP和NSP细胞的干性。3.提取分选后的SP和NSP细胞RNA,进行人全基因表达谱芯片分析。4.使用GO聚类和KEGG通路富集对差异表达基因进行功能分析。5.荧光定量PCR对筛选出的差异表达最大的前10个基因进行表达验证。6.构建候选差异基因过表达或者沉默的慢病毒质粒。并通过荧光显微镜和流式细胞术评估转染效率。7.CCK-8和平板克隆实验,分析候选基因对MG-63细胞增殖和分化能力的影响;Transwell小室和划痕实验,分析候选基因对MG-63细胞侵袭和迁移能力的影响;MTT和凋亡实验分析候选基因与MG-63细胞对化疗药物的敏感性的关系。结果:1.当细胞密度为9×10~5个/mL、Hoechst 33342终浓度为5μg/mL时,MG-63 SP细胞的比例最高,为1.45%±0.23%。2.与NSP细胞相比,SP细胞内干性标志基因NANOG、SOX2和Oct-4均上调表达;SP细胞增殖速率较NSP细胞快;顺铂对SP细胞的IC50大于NSP细胞,差异有统计学意义;与NSP细胞相比,耐药相关基因MRP、XRCC1、MGMT和ABCG2在SP中均上调表达。3.基因芯片检测结果显示,SP与NSP细胞比较一共检测出7,332个差异基因,其中3,661个基因在SP细胞中表达上调,3,671个基因表达下调。4.差异基因GO聚类分析结果显示,筛选出的差异表达基因与分子功能调控相关55项,主要包括激酶活性(24%)、通道活性(20%)、转运蛋白活性(20%),其中跨膜转运蛋白活性占(18%)、受体活性(16%)和结合(15%);参与生物过程231项,主要包括功能调节(33%),其中正调控占(9%),负调控占(8%)、细胞黏附(3%)、系统进程(3%)、细胞生物过程(6%)。差异基因KEGG pathway富集结果显示,筛选出的差异基因共参与通路31条。主要包括PI3K-Akt信号通路、神经活性配体-受体相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、癌症中的转录失调等。5.PCR验证基因芯片结果显示,在选择验证的十个差异基因中,有两个差异基因表达情况与芯片数据相反,准确率为80%。6.生物信息学分析结合荧光定量PCR验证结果,选择KLK5、RAPH1和TFPI为候选差异表达基因。7.采用慢病毒质粒转染MG-63细胞,经嘌呤霉素筛选成功构建KLK5过表达(KLK5~+)及其阴性对照(KLK5-NC)的MG-63细胞株;RAPH1沉默(shRAPH1)及其阴性对照(RAPH1-NC)的MG-63细胞株;TFPI沉默(shTFPI2)及其阴性对照(TFPI2-NC)的MG-63细胞株。8.细胞生物学功能实验结果表明,与RAPH1-NC相比,shRAPH1细胞的增殖和分化能力有所提高,表现出更强的迁移和侵袭能力,对顺铂的敏感性减弱。与TFPI2-NC相比,shTFPI2细胞的增殖和分化能力有所提高,对顺铂、阿霉素和紫杉醇的敏感性减弱。与KLK5-NC相比,KLK5+细胞的增殖和分化能力有所提高,迁移和侵袭能力均显著增强,对顺铂的敏感性减弱。结论:1.流式细胞仪分选出的人骨肉瘤细胞系MG-63 SP细胞具有肿瘤干细胞的特性,包括自我更新和分化潜能,并可以导致顺铂耐药。2.KLK5基因具有促进骨肉瘤细胞的增殖、分化、迁移和侵袭能力,减弱对顺铂的敏感性。RAPH1和TFPI的作用与KLK5基因相反。3.KLK5、RAPH1和TFPI2有可能成为骨肉瘤治疗的靶点和骨肉瘤干细胞特异性诊断分子标记物。