【摘 要】
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CRISPR/Cas9系统是目前使用最广泛的第三代基因编辑技术,目前在多种模式生物、商品化动植物相关的育种改良工程中都有成功报道。番茄（Solanum lycopersicum.L）果实的外观色泽是影响其商品价值的主要因素,因此果实成熟时的色泽转变过程受到高度关注。番茄果实的后熟调控网络较为复杂,乙烯途径和类胡萝卜素合成代谢途径参与色泽代谢中的研究已较为深入;但上游调控后熟及有色体转变的机制目前尚
【基金项目】
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国家重点基础发展研究计划项目（2013CB127105）；
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CRISPR/Cas9系统是目前使用最广泛的第三代基因编辑技术,目前在多种模式生物、商品化动植物相关的育种改良工程中都有成功报道。番茄（Solanum lycopersicum.L）果实的外观色泽是影响其商品价值的主要因素,因此果实成熟时的色泽转变过程受到高度关注。番茄果实的后熟调控网络较为复杂,乙烯途径和类胡萝卜素合成代谢途径参与色泽代谢中的研究已较为深入;但上游调控后熟及有色体转变的机制目前尚不明确。有研究表明,具有PAP-Fibrillin结构域的质体脂类家族蛋白,在有色体内膜形成、果实中的类胡萝卜素储运等过程中起到调控作用。该家族成员中的番茄质体类胡萝卜素相关蛋白（Sl CHRC,Chromoplast-associated Carotenoid-binding Protein）在果实后熟色泽转变过程起一定的作用,但研究仅限蛋白质组学和组织表达水平的部分内容,缺乏遗传学相关的功能验证分析。本论文以Micro-Tom（cv.dwarf/u）模式番茄为研究材料,应用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究了可能参与有色体形成的Sl CHRC基因的功能,具有重要的理论和实践意义。主要研究结果如下:（1）以Sl PDS为初始靶基因,获得Cas9-pds两株杂合突变体,首次在本实验构建番茄CRISPR/Cas9技术应用体系。（2）通过物种进化树分析Sl CHRC和其他近远源物种的家族基因发现,该基因与茄科属多数物种的PAPs/Fibrillin蛋白同源性较高,并发现Sl CHRC蛋白定位在叶绿体。（3）Sl CHRC在花瓣中表达最高,在叶片、绿熟期和转色期果实中均有表达,在根组织中基本不表达。（4）乙烯处理促进了果实叶绿素降解和类胡萝卜素的积累,并促进了Sl CHRC小幅上调表达;而1-MCP处理则抑制了上述进程。（5）构建了靶向Sl CHRC基因的CRISPR/Cas9编辑系统（p YLCRISPR/Cas9-T#Sl CHRC）,成功得到Cas9-chrc三株突变体植株;转录本c DNA分析发现Sl CHRC出现缩短的编码氨基酸链,对应的氨基酸序列均出现移码突变。三个MT番茄突变体株系的果实均出现明显表型:幼叶颜色深绿,复叶减少,整个植株株高下降;果皮转色大幅延迟,可溶性固形物含量、萼片重量等方面出现差异,并存在种子发育缺陷的现象。综上所述,本文在模式番茄Micro-Tom上敲除Sl PDS基因,成功应用了CRISPR/Cas9基因编辑技术,敲除Sl CHRC基因获得了T0代有效突变株系,进一步认识该基因的遗传学功能:番茄CHRC基因表达受乙烯信号诱导,其蛋白定位于叶绿体,可能影响番茄果实的后熟转色过程,推测它也在种子的发育过程起到重要作用。
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