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研究背景及目的：目前在滋养细胞肿瘤的治疗中,耐药是最棘手的问题。肿瘤细胞形成耐药的机制极其复杂,滋养细胞肿瘤的耐药机制也至今为止尚未明确。在本课题组前期的工作中,成功建立了采用间断和连续两种不同的诱导方法诱导的五种临床滋养细胞肿瘤化疗常用药物(FUDR/5-Fu/MTX/KSM/VP-16)的绒毛膜上皮癌JeG-3细胞耐药细胞株。JeG-3亲本敏感株与FUDR耐药株的基因芯片结果,提示ANXA3基因在两株细胞间存在明显差异,鉴于在多种肿瘤中Annexin A3蛋白均被证实与肿瘤的预后、耐药相关,且查阅文献发现目前没有Annexin A3在滋养细胞肿瘤中研究的报道,因此我们试图初步探讨该蛋白在滋养细胞肿瘤的表达情况,并且进一步证实其是否在绒癌JeG-3细胞株及各耐药细胞株间存在表达差异。体外细胞培养是研究耐药机制的很好的平台与基础,但肿瘤细胞在活体的耐药机制可能更为复杂；而且由于滋养细胞肿瘤有可依靠化疗治愈的特殊性,初始的未经过化疗的绒癌临床病理标本取得很困难,因此要观察活体内蛋白表达情况并且验证JeG-3亲本细胞株与JeG-3/FUDR耐药细胞株在活体内的耐药性是否与体外培养相符,都需要依靠动物模型。本研究动物实验的目的为建立绒癌细胞株移植瘤动物模型,测定绒癌JeG-3/FUDR耐药细胞株活体移植瘤的耐药性,并观察Annexin A3在活体瘤内表达情况。研究方法：1.使用细胞计数法检测各个耐药细胞株在停药18个月后的耐药指数(RI)以评定耐药性,并以高浓度继续间断诱导耐药株,在停药6月后检测耐药性的变化。2.用Western Blot法验证Annexin A3蛋白在敏感株及耐药株间的表达差异。3.用荧光定量PCR法验证mRNA水平ANXA3基因在敏感株及耐药株间的表达差异。并在基因表达较敏感株升高的JeG-3/FUDR耐药株、JeG-3/MTX耐药株中检测间断耐药至各浓度梯度时ANXA3基因的变化。4.建立裸鼠绒癌移植瘤模型,分别以JeG-3敏感株及JeG-3/FUDR耐药株皮下接种成瘤,摸索FUDR药物作用的合适剂量,并检测活体移植瘤的耐药性。5.观察绒癌成瘤的组织学形态、裸鼠模型血清β HCG水平,用免疫组织化学法测定Annexin A3蛋白在活体瘤组织中的表达情况。研究结果1.停药18个月后大部分耐药细胞株的耐药性降低不明显,耐药性仍稳定。在原耐药株基础上,继续加入高浓度化疗药间断诱导的细胞株,在停药半年检测耐药性,发现RI有降低趋势。2.经Western Blot验证,JeG-3/FUDR耐药株、JeG-3/MTX耐药株细胞中Annexin A3蛋白表达明显高于敏感株,而JeG-3/KSM耐药株及JeG-3/VP16耐药株与亲本细胞株未显示出差异。3.经荧光定量PCR验证,JeG-3/FUDR耐药株、JeG-3/MTX耐药株ANXA3基因在1nRNA水平较亲本JeG-3细胞显著升高。JeG-3/VP16耐药株ANXA3基因较亲本细胞株表达下降,但差异无显著性。通过荧光定量PCR验证的结果与基因芯片结果一致。4.建立绒癌JeG-3敏感株及JeG-3/FUDR耐药株细胞裸鼠皮下移植瘤模型,摸索出合适的FUDR腹腔注射剂量为62.5ug/g鼠重；在活体内,FUDR对二者所成皮下瘤体的抑瘤率无明显差异。5.免疫组化结果显示Annexin A3在绒癌瘤组织中有表达,呈胞浆及胞膜表达。镜下见在FUDR耐药株成瘤中的表达强于敏感株成瘤,与细胞水平的研究结果相符。结论：1.前期构建的绒癌耐药细胞株耐药性稳定,但继续给予大剂量冲击式诱导可造成细胞耐药性的下降,大剂量冲击式诱导法不适合作为绒癌耐药细胞株的诱导方法。2.Annexin A3在绒癌细胞株中表达,JeG-3/FUDR、JeG-3/MTX耐药细胞株与敏感细胞株相比该蛋白表达升高,在mRNA水平ANXA3基因水平变化也呈现相同的趋势,提示该蛋白的表达可能与FUDR、MTX的耐药相关。3.成功建立了裸鼠绒癌细胞皮下移植瘤模型,移植瘤的生物学特点表现了绒癌的特征。FUDR对JeG-3/FUDR耐药株与敏感株在活体内所成瘤的抑瘤率无明显差异。4.Annexin A3在绒癌活体瘤组织中呈胞浆及胞膜表达,FUDR耐药株成瘤中的表达强于敏感株成瘤,与细胞水平的研究结果相符。