脆性X综合征[fragile X syndrome，Fra(X)]是最常见的遗传性智力低下疾病之一，在X连锁智力低下患者中占40％，占非特异性智力低下患者的2％～6％。目前认为Fra(X)致病机制主要是由于脆性X智力低下一号基因(fragileX mental retardation-1 gene，FMR1)启动子区内(CGG)n三核苷酸重复序列的不稳定扩增及其上游的CpG岛的异常甲基化，使FMR1基因转录及翻译终止，其编码产物——脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，FMRP)减少或缺如，最终表现为Fra(X)。该基因在正常人体脑、睾丸以及外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)均有着广泛的表达。近来认为，CpG岛有无异常甲基化比(CGG)n重复序列异常扩增对表型的影响更为重要。已证实FMR1基因启动子区存在一个具有增强子活性的甲基化敏感区(methylation sensitive element，MSE)，该区增强子内又同时包含一个cAMP反应单位(cAMP-responsive element，CRE)碱基序列。研究发现Fra(X)患者和体外模型FMR1基因封闭后细胞内cAMP水平下降，FMR1基因(CGG)n三核苷酸片段扩增大小与cAMP含量呈负相关，随着FMR1的编码蛋白——脆性X智力低下蛋白的表达增加，细胞内cAMP的产量明显增加。以上资料提示，FMR1基因和cAMP二者之间可能存在相互调控关系。采用药物提高以细胞内cAMP水平是否可以诱导沉默FMR1基因的转录和表达呢?国内外尚未见相关的报道。我们前期研究了FMR1基因封闭后对cAMP代谢过程中的两个关键酶——腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)及磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)活性的影响，在国内外首次提出，腺苷酸环化酶活性抑制可能是Fra(X)患者细胞内cAMP水平降低的主要原因。本研究试图采用腺苷酸环化酶激活剂提高细胞内cAMP水平，初步探讨该药物重新激活封闭FMR1基因的可能性；初步比较腺苷酸环化酶激活剂、去甲基化药物、促组蛋白乙酰化药物诱导封闭FMR1基因重新活化的效果，旨在为应用提高细胞内cAMP水平的药物诱导沉默FMR1基因的转录和表达，为Fra(X)患者治疗探索一种新的思路和新的治疗方法。研究方法：1、采用硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)封闭FMR1基因，制作外周血单个核细胞和PC12神经细胞FMR1基因封闭的细胞模型：硝普钠可诱导FMR1启动子的高度甲基化，阻断转录因子与启动子的结合，从而抑制了FMR1 mRNA的转录。PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤原代细胞，已用于构建多种神经系统疾病的细胞模型。在PBMC细胞模型中给予硝普钠500umol／L，PC12细胞模型中给予硝普钠为1000umol／L，48小时内更换新鲜配制的硝普钠药物。通过RT-PCR观察FMR1基因的封闭情况。2、腺苷酸环化酶特异性激活剂弗司可林(forskolin，FSK)诱导FMR1基因封闭的重新表达：以上述建立的Fra(X)细胞模型为基础，在给予硝普钠封闭FMR1后第12h分别向细胞培养基中添加弗司可林，继以在弗司可林作用满24h后收集细胞，提取RNA，通过RT-PCR检测FMR1基因的重新活化情况。3、在PBMC细胞模型中，三类药物对FMR1封闭基因诱导作用的比较：在PBMC建立的Fra(X)细胞模型中，于硝普钠封闭FMR1第12h后，分别加入弗司可林、5-氮脱氧胞嘧啶(5-Aza-dC)和丁酸钠(sodium butyrate)，分别在添加药物后满12h、24h、36h、48h以及72h收集细胞，提取RNA，进行RT-PCR，在Doc Gel 2000凝胶扫描成像系统下分析FMR1基因的半定量的表达情况。数值采用SPSS 11.5软件进行统计学分析处理。4、在PC12细胞模型中，三类药物对FMR1封闭基因诱导作用的比较：以PC12细胞建立的Fra(X)细胞模型中，在硝普钠封闭FMR1第12h后分别加入上述三类药物，分别在各种药物作用满24h、48h以及72h收集细胞，提取RNA，其他方法同上。5、用RT-PCR钓取正常对照组FMR1基因与甲基化封闭后被弗司可林重新活化的基因片段，将所获得片段送至拓普公司进行克隆、测序，用Chromas软件进行查看、校正，BLAST软件进行比对。研究结果：1、人外周血单个核细胞和PC12细胞中FMR1体外封闭的结果：正常对照电泳结果出现约250bp及500bp两条带，前者为内参照物甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的扩增片段；后者为FMR1基因的扩增片段，经测序与Genebank报道序列完全一致。两种细胞模型实验组中第12h、24h、48h均只有约250bp一条带出现，表现为FMR1基因封闭效应；第72h又出现两条带，即重新出现FMR1基因的表达。如果在48h内更换硝普钠可以获得持续的封闭效果。光镜下硝普钠封闭前后细胞形态无明显变化。2、人外周血单个核细胞模型中，弗司可林诱导FMR1封闭基因转录的结果：细胞在添加弗司可林后培养满24h，RT-PCR均可扩增出与目的基因大小一致的片段，经测序与Genebank报道序列完全一致，表明弗司可林可以重新诱导已封闭FMR1基因的体外转录。3、PC12细胞模型中，弗司可林诱导FMR1封闭基因转录的结果：细胞在添加弗司可林后培养满24h出现FMR1表达，表明弗司可林可以重新诱导已封闭FMR1基因的体外转录。4、人外周血单个核细胞模型中，三类药物诱导FMR1封闭基因重新表达水平的比较：封闭处理的细胞在给予弗司可林后24h至72h出现目的条带；5-Aza-dC组在给与去甲基化药物5-Aza-dC后，在12h至72h也出现目的条带；显示弗司可林活化FMR1封闭基因的起效时间较晚；两药诱导封闭FMR1重新表达的峰值均在48h时出现，其中弗司可林组诱导作用最高峰值可达到正常细胞FMR1基因转录水平的75.59％，在第72h弗司可林组的FMR1基因转录水平下降平缓，有较5-Aza-dC诱导活化作用的时间延续更久的趋势；且FSK组与5-Aza-dC组这两组组间差异有显著性统计学意义(p＜0.05)。而丁酸钠组在给予药物后上述时间点均无目的条带出现。5、在PC12细胞模型中，三类药物诱导FMR1封闭基因重新表达水平的比较：与人外周血单个核细胞模型比较，弗司可林和5-Aza-dC诱导FMR1封闭基因重新表达的起始时间、峰值时间、延续的趋势较相似，但FSK组与5-Aza-dC组这两组组间差异无显著性(p＞0.05)。弗司可林组诱导作用最高峰值可达到正常细胞FMR1基因转录水平的76.83％，两种细胞模型弗司可林组FMR1基因开启转录水平无显著差异。而丁酸钠组在给予药物后上述时间点均无目的条带出现。结论：1、借鉴硝普钠可在体外成功制作人外周血单个核细胞FMR1封闭基因的细胞模型的经验，采用1000umol／L硝普钠可有效地封闭PC12细胞FMR1基因表达，首次成功地制作了一个简单可靠的Fra(x)细胞模型，这对在我国目前缺少动物模型的情况下具有重要的实用价值。2、在已经建立的FMR1封闭细胞模型的基础上，利用腺苷酸环化酶激活剂(弗司可林)提高细胞内cAMP水平，诱导封闭的FMR1基因重新表达，首次发现cAMP水平的增高可以促进已经封闭的FMR1基因的重新表达，且其对转录水平的诱导作用可达75％左右。由此提示，FMR1基因与cAMP之间可能存在相互促进或调控的作用机制。这一发现为从基因水平上改善Fra(X)患者的病理状况，为Fra(X)的药物性基因治疗提供了一种新思路和希望。3、通过将腺苷酸环化酶激活剂弗司可林和已证实可诱导FMR1封闭基因活化的去甲基化药物5-Aza-dC比较，本研究发现二者均能有效地重新激活已封闭的FMR1基因，并且二者的作用峰值出现时间相一致；但是弗司可林的起效较晚，作用较平缓，诱导活化作用的时间有持久的趋势。而单独给予组蛋白去乙酰化酶抑制剂并不能有效地激活该基因。