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绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是现在研究和应用最多的虫生真菌之一,其分泌的多种酶与侵染寄主有关。有研究报道绿僵菌(Metarhizium spp.)分泌的一种新的胞外酪氨酸蛋白磷酸酶能够在体外特异性地改变蝗虫信号转导相关蛋白Toll受体和Trans-Golgi p230蛋白磷酸化状态,推测该磷酸酶可能影响寄主蝗虫的体液免疫。本课题组在研究该新的胞外酪氨酸蛋白磷酸酶时发现了一段新的序列,该序列由绿僵菌胞外酪氨酸蛋白磷酸酶(?)nRNA前体(hnRNA)经不同剪接方式产生,其与李振轮等学者研究绿僵菌酪氨酸蛋白磷酸酶(GenBank登录号No. DQ302474、No.EFY93239)同源,并且含有酪氨酸蛋白磷酸酶的标志基序,推测该新的序列表达蛋白可能是一个新的酪氨酸蛋白磷酸酶。但是目前对于其结构、生化特性与功能等尚不清楚。本试验以金龟子绿僵菌蝗变种(Metarhizium anisopliae var. acridum) CQMa102菌株为研究材料,通过构建巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)蛋白表达系统,对该新的序列进行基因克隆、蛋白表达,并进行酶特性分析,以期望从分子水平初步分析该蛋白,为后续研究人员从不同水平分析绿僵菌蛋白磷酸酶对蝗虫体液免疫防御的影响提供物质基础。为了获得足够量的活性良好的蛋白用于分析研究其生化特性,我们对该蛋白基因序列进行克隆,构建了携带目的基因ptp编码序列的重组表达质粒pPIC9K-ptp,通过电转化法转入毕赤酵母KM71中,得到重组子9k-PTPase。重组菌株在诱导表达培养基(BMMY)中诱导外源基因表达,SDS-PAGE和蛋白印迹结果显示9k-PTPase成功表达了目标蛋白,并初步确定蛋白表观分子量近似为91kDa。对发酵条件进行优化后确定最佳诱导条件为以1%甲醇诱导浓度诱导培养毕赤酵母120h时表达外源蛋白相对酶活性最高。以该最佳发酵条件进行外源蛋白大规模诱导表达,9k-PTPase表达上清浓缩后经His Trap亲和柱纯化得到的蛋白纯度和均一性良好,IEF-PAGE分析染色后确定其为磷酸酶,并且该磷酸酶pI近似为6.88。对磷酸酶进行生化特性分析发现：(1)该磷酸酶对5mM O-phospho-L-tryosine的最适作用温度为50℃、最适作用pH为5.5。(2)磷酸酶底物特异性研究表明该磷酸酶对pTyr酶解活性显著高于其他底物,表明该磷酸酶是蛋白磷酸酶。(3)磷酸酶抑制剂研究发现丝氨酸/氨酸蛋白磷酸酶抑制剂(NaF、EDTA)、酸性磷酸酶抑制剂(EDTA)和碱性磷酸酶抑制剂(EDTA)对该磷酸酶酶解pNPP没有显著抑制作用,表明磷酸酶不是丝氨酸/氨酸蛋白磷酸酶；对碱性磷酸酶有强烈激活作用的金属离子Ca2+、Mg2+在试验中对磷酸酶酶解pNPP也没有显著激活作用,反而抑制酶降解pNPP活性,表明该蛋白磷酸酶不是碱性磷酸酶；但是酪氨酸蛋白磷酸酶抑制剂(钼酸钠、钨酸钠)显著抑制酶对pNPP的活性,但是并没有直接证据表明目标蛋白是酪氨酸蛋白磷酸酶,又该酶对pThr、pSer和pNPP也具有较高活性,因此该磷酸酶为表现双特异性磷酸酶活性的蛋白磷酸酶。(4)MnSO4及lmM的Fe2+、Ba2+、Ca2+促进酶降解ρNPP活性,高于1mM则会表现抑制作用；Zn2+、Ag+、Cu2+显著抑制酶水解pNPP的活性,Mg2+对酶作用pNPP没有明显影响。