研究背景和目的：乳腺癌是世界女性肿瘤中最常见的一种恶性肿瘤。我国乳腺癌发病率低于欧美等发达国家。随着经济和社会的发展及生活方式的改变,我国乳腺癌发病率不断升高且发病年龄年轻化。据世界卫生组织国际癌症研究中心（International Agency for Research on Cancer,IARC）统计2008年中国女性乳腺癌标化发病率为21.6/100000,在全球184个有统计资料的国家中位列第99位,标化死亡率为5.7/100000,位列第145位,均显著低于世界平均水平。但是由于人口基数大,占世界新诊断乳腺癌的12.2%,死亡例数占世界乳腺癌死亡人数的9.6%。乳腺癌成为我国防癌重点。乳腺癌是一种复杂疾病,其发生发展是遗传背景、体内激素水平、免疫状态、生理条件、生活习惯、环境等多因素、多步骤综合作用的结果。生活方式在肿瘤的发生中扮演着重要角色。可以通过改善饮食、控制体重、减少酒精摄入和吸烟来降低患癌风险。年龄、性别、遗传背景是乳腺癌的高危因素。女性患乳腺癌的风险是男性的100倍,因为乳腺癌细胞长期暴露在具有促生长作用的雌激素和孕激素中。乳腺癌的患病也与年龄相关,乳腺癌和卵巢癌绝经后发病率更高,提示大多数的乳腺癌是由于易感基因遗传缺陷的累积作用才导致的。约15%的乳腺癌病人有家族史。病人及其家属获得遗传缺陷的可能性更大,其发病年龄可能更早。乳腺癌发生发展是多基因多阶段协同作用的结果,从致癌物质发挥作用到肿瘤的形成过程中涉及多种外显性不同的易感基因的异常活动。乳腺癌易感基因可分为高外显性突变、中外显性易感基因和低外显性易感基因。与乳腺癌相关的高外显性基因主要是BRCA1和BRCA2,其次还有TP53、PTEN、CDH1 STK11。BRCA1/2突变以常染色显性方式遗传,但在细胞水平以隐性方式作为抑癌基因维持双链DNA的稳定。BRCAl/2女性携带者患病风险是45-87%。男性BRCA1突变携带者患病风险增加,但比BRCA2携带者患病风险低。其它女性癌症患病风险也会增加。BRCA1突变携带者患卵巢癌的风险是45-60%,BRCA2携带者的患病风险是11-35%。一些发达国家已经开展了对于适当选择的病人进行这些基因的遗传咨询和遗传检测,并对突变携带者给予早期筛查与预防干预措施。BRCA1/2可以解释15%的家族性乳腺癌,联合其他高外显性基因可以解释25%的家族性乳腺癌。关联分析未能发现其他高外显性乳腺癌易感基因,提示发展新的寻找乳腺癌易感基因的方法。许多研究将焦点放在那些细胞功能明确、可能会增加乳腺癌风险的基因。研究发现许多与BRCA1/2或通路相互作用的DNA修复基因,CHEK2、BRIP1、ATM、PALB2等2倍增加乳腺癌患病风险。RAD51是同源重组中的重要基因。RAD51多态性中研究最为广泛的两个SNPs位点是Rs1801320（G135C）和rs1801321 （G172T）。这两个位点均位于5’UTR区,可能与功能相关。这两个位点会影响mRNA的稳定性和翻译的效率,影响多肽序列,改变RAD51蛋白的功能,进而一定程度地影响同源修复。中外显性易感基因的突变对遗传性乳腺癌的贡献为20-30%,表明还有其他的易感基因与乳腺癌的发生风险相关。随着实验技术的提升和测序技术的进步,全基因组关联分析发现其他乳腺癌易感基因可能以多基因的形式作用与癌症的发生。针对乳腺癌这类复杂性疾病,国外主要从群体遗传学入手（大、中、小人群关联分析研究和全基因扫描分析）,又寻找了大量的易感基因和风险位点。如FGFR2, TNRC9, MAP3K1, LSP1, RAD51, ESR1, TOX等。目前关于乳腺癌的全基因组关联分析,涉及20多个基因（ABHD8, ABCC4, ACTL7A, ANKLE1, ANKRD16, CCND1, CDKN2A, CDKN2B, COL1A1, ECHDC1, ESR1, FBN1, FBXO18, FGF19, FGF3, FGF4, FGFR2, GLG1, GRIK1, KLF4, LOC643714, LSP1, MAP3K1, MRPS30, MYEOV, ORAOV1, RAD23B, RAD51L1, RNF146, ROPN1L, SLC4A7, TNRC9, TOX3,ZMIZ1,ZNF）,发现50多个与乳腺癌发病密切相关的SNP位点。这些低外显性易感基因及易感位点尚未在临床上直接应用,更多的是构建风险评估模型后用于高危人群的筛查。乳腺癌发生发展是多基因多阶段协同作用的结果,随着越来越多外显性不同的乳腺癌易感基因的鉴定,对乳腺癌易感基因遗传多态性的认识更系统全面,研发更适宜准确的遗传检测技术,更好的理解和选择合适的预防措施。本研究基于SNP技术和二代测序技术开展对高、中外显性乳腺癌易感基因的研究,结合课题组已筛选的低外显性易感基因或位点,奠定中国女性乳腺癌遗传多态性数据基础,为乳腺癌高危人群的早期筛查以及个体化预防和治疗奠定基础,并建立高外显性易感基因BRCA1/2更全面、便利地检测技术。研究方法：1.研究对象的收集收集样本165例发病年龄小于40岁的早发性乳腺癌和66例有一名或以上一级或二级亲属患癌症的家族性乳腺癌用于BRCA1/2报道的常见突变检测；从166例病例中挑选出收集46例发病年龄小于或等于35岁的早发性乳腺癌用于BRCA1/2外显子测序研究。根据病例对照研究设计,收集广东和山东地区散发性乳腺癌病例及同期的健康女性对照全血样本及相应临床信息,用于中外显性易感基因检测；中外显性研究在山东和广东地区共收集1066例样本,包括524例散发性乳腺癌和同期收集的542例健康对照女性。524例散发性乳腺癌包括山东地区乳腺癌病人241例、广东地区乳腺癌病人283例；两个地区正常对照分别为230例、312例。2. BRCA1/2热点突变位点检测从BIC数据库和关于亚洲或中国相关人群报道的文献中选出报道比较多的突变位点进行检测。用Sequenom MassARRAY（?）-IPLEX检测平台在中国汉族女性遗传性乳腺癌中检测BRCA1/2常见报道突变3. BRCA1/2外显子测序采用靶向捕获技术结合二代测序技术平台对BRCA1和BRCA2基因全部外显子区域进行基因测序。并对测序数据进行分析。4.乳腺癌中外显性易感基因检测从NCBI的SNP信息数据库、全基因组关联分析以及其它国内外大样本研究得到的阳性位点中挑选出可能的乳腺癌中外显性易感SNP位点。利用Sequenom MassARRAY（?）-IPLEX检测平台在中国汉族女性散发性乳腺癌患者和健康对照者中进行基因多态性分型,整理检测结果并利用在线网站（http://bioinfo.iconcologia.net/SNPstats）进行相关统计分析。分别在共显性模型（Codominant model）、显性模型（Dominant model）、隐性模型（Recessive model）、超显性模型（Overdominant model）和附加模型（Log-additive model）五种遗传模型中探讨各个位点的多态性分布与乳腺癌患病风险的关系,筛选适合中国汉族女性的乳腺癌中外显性易感SNPs位点。结果：第一部分中国汉族女性遗传性乳腺癌BRCA1/2突变分析对165例早发性乳腺癌和66例家族性乳腺癌检测在BRCA1基因并未发现突变。在BRCA2基因上发现了两个热点突变位点,分别是rs80359352、rs11571661。在1例早发性和1例家族性乳腺癌中发现rs80359352。 rs80359352位于BRCA2外显子11,3036₃039delACAA导致移码突变,氨基酸编码提前在958位密码子终止。在21例早发性和10例家族性乳腺癌中rs11571661纯合缺失,73例早发性和27例家族性乳腺癌中发现杂合子,66例早发性和24例家族性为野生型。该突变位于BRCA2基因内含子11,从第80位碱基缺失TTAA。对46个35岁前早发性乳腺癌样本进行捕获测序,发现5例样本携带6个有害突变,BRCA1/2在早发性乳腺癌中的突变率是10.87%,均为移码突变。其中发现1例BRCA1突变（H1N, p.Leu502_Lys503?fs）和4例BRCA2突变（NFBC70, c.182de1T;NFBC2,c.5164₅165delAG;17N,c.6096dupT;NFBC145,c.9353₉354insTTCTTGA, c.9355₉356insAGACTGCCTTTACC）o还发现了12个BRCA1稀有突变,包括2个意义不明的错义突变I91T和M119T,前者在BIC数据库中报道过,但其意义仍不明确；19个BRCA2稀有突变,包括8个意义不明的错义突变Y42C、 H400R、M784V、K1729T、R2108C、W2619C、K2729N、I3412V, Y42C、H400R、 M784V、K2729N等4个错义突变在BIC数据库中报道过。第二部分中外显性基因多态性与乳腺癌易感性本研究选取了10个基因位或区域的11个位点,在山东和广东地区共1066例样本,包括524例散发性乳腺癌和542例健康对照女性进行联合分析。结果显示,除rs7166081这个位点,其他位点的基因分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）且在所研究样本中存在多态性。病例对照分析发现1个与乳腺癌发病风险相关的多态性位点,rs10941679,符合共显性、显性、超显性遗传模型。与G/G基因型相比,携带G/A或G/A-A/A基因型可降低个体的患病风险,OR值（95%CI）分别为0.63（0.45-0.88）,P=0.021和0.68（0.49-0.93）,P=0.016,与纯合型G/G-A/A相比,杂合基因型G/A也与个体的患病风险相关,OR值（95%CI）为0.70（0.53-0.92）,P=0.011。对不同地区来源的样本进行分层分析后发现：1)山东女性中,rs1801320携带G/C基因型可增加乳腺癌患病风险,OR值（95%CI）分别为2.03（1.30-3.17）,P=0.0064;2)广东女性中,位点rs6138178的G/T基因型可增加乳腺癌患病风险,OR值（95%CI）分别为1.65（1.16-2.33）,P=0.018；rs10941679的G/A-AA基因型可降低乳腺癌患病风险,OR值（95%CI）为0.63（0.41-0.97）,P=0.034。结论：第一部分中国汉族女性遗传性乳腺癌BRCA1/2突变分析在遗传性乳腺癌中发现2个常见突变位点rs80359352和rs11571661,并未发现大片段缺失或重复突变。通过对46例中国华南汉族早发性乳腺癌患者的BRCA1和BRCA2基因的外显子区域进行基因测序,发现6个BRCA有害突变,并找到了一些稀有突变。本研究补充了BRCA1/2突变谱,可以更好更全面的反应BRCA1//2突变携带情况,为乳腺癌的预防奠定基础。第二部分中外显性基因多态性与乳腺癌易感性本研究共筛选出3个与乳腺癌易感性相关的中外显性SNPs位点,分别为rs10941679、rs1801320和rs10941679。它们均可不同程度的增加或降低乳腺癌的发病风险。rs10941679与整体中国和广东汉族女性乳腺癌相关,会降低乳腺癌的患病风险。rs1801320仅与山东汉族女性乳腺癌相关,增加山东汉族女性乳腺癌患病风险。rs6138178G/T是广东汉族女性的危险基因型。