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目的MicroRNAs是重要的基因调控因子，被认为在肿瘤发生过程中起着关键的作用。本课题组前期芯片研究显示miR-142-3p在结直肠癌组织中表达水平显著升高。查阅文献资料，已有一些研究报道了miR-142-3p在肝癌、食管癌等恶性肿瘤中的异常表达，并与肿瘤恶性生物学行为密切相关。因此，本研究以miR-142-3p为研究对象，检测miR-142-3p在结直肠癌组织中及一些肠癌细胞株中的表达情况；通过网路数据库及生物软件，预测miR-142-3p可能调控的靶基因；通过双荧光素酶实验、RT-PCR、WesternBlot、免疫组化等方法验证miR-142-3p和靶基因间的相互作用关系；构建过表达和基因沉默载体，在体外和体内试验中探讨miR-142-3p的表达水平变化对对结直肠癌生物学行为的影响；并通过对其调控的靶基因参与的信号通路的分析研究，探讨miR-142-3p对结直肠癌发生、发展、转移的调控机制。方法1. Real-time RT-PCR方法检测miR-142-3p在60例结直肠癌组织及3种结肠癌细胞株中的表达情况；结果与这些组织样本的的临床病理特征进行分析。2.以miR-142-3p中等表达的人肠癌SW480细胞株为研究对象，应用三种生物信息学软件和在线网络数据库对miR-142-3p的靶基因进行预测，分析结合位点；构建miR-142-3p正义表达载体和靶基因3’UTR荧光素酶载体，应用双荧光素酶报告基因技术分析miR-142-3p对靶基因的转录激活活性；通过对靶基因mRNA、蛋白表达产物的检测，确定miR-142-3p对靶基因的调控方式；并进一步采用RT-PCR、WesternBlot和免疫组化方法检测靶基因在结直肠癌组织细胞及其他肿瘤细胞中的表达情况。3.设计并构建miR-142-3p过表达载体pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miRNA-142-3p和沉默载体pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miRNA-142-3p-Silencer，同时设计miRNA-无关序列作为阴性对照（negative control，NC），并构建表达载体；培养SW480细胞，以脂质体法转染细胞，荧光显微镜观察，以最高转染效率和最低细胞死亡率为原则，优化转染条件，根据优化的条件将pPG/miR/eGFP/Blasticidin质粒转染肠癌SW480细胞；经Blasticidin筛选，获得稳定转染表达的单克隆SW480细胞；应用real-timeRT-PCR检测转染效率，并用RT-PCR和Western Blot方法检测稳转细胞株靶基因TCF7的mRNA及蛋白表达情况，筛选出干预效果最好各组稳转细胞株用于后续实验。4.设计空白对照组(Blank组， SW480细胞株)、阴性对照组（NC组，PG/miR/eGFP/Blasticidin-miRNA-NC质粒转染的SW480细胞）、正义实验组（PG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-142-3p质粒转染的SW480细胞）和反义实验组（PG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-142-3p-Silencer质粒转染的SW480细胞）为研究对象，应用CCK-8实验及克隆形成实验检测四组细胞的增殖能力；应用流式细胞仪检测四组细胞的细胞周期分布；进行5-Fu对各组肠癌细胞生长的抑制试验，检测四组细胞对5-Fu的药物敏感性，并观察药物作用48h后细胞周期的变化及凋亡率；通过裸鼠移植瘤实验，观察四组细胞的成瘤情况，并通过免疫组织化学方法检测各组移植瘤组织中TCF7，RAC1，KI-67，CyclinD1等基因的表达情况。结果1. miR-142-3p在结直肠癌组织及肿瘤细胞株中的表达：我们检测的60例结直肠癌组织中miR-142-3p的表达均较癌旁正常粘膜上皮组织上调；miR-142-3p在肠癌细胞株SW480, DLD-1, HCT116中的表达水平均较人胚胎肠粘膜细胞CCC-HIE-2上调，结果与组织中的表达情况一致。与临床病理特征分析显示，miR-142-3p特异性高表达与结直肠癌组织分化程度及肿瘤局部浸润程度密切相关，而与其他临床病理特征无关。2.生物信息学分析：MiRanda3.3a、RNAhybrid2.1、TargetSpy三种软件和三种在线数据库TargetScan, miRBase, PicTar algorithms预测了miR-142-3p的靶基因TCF7；Blast数据库比对表明，TCF7的3’UTR区存在与miR-142-3p5’端相互作用的序列，且此结合位点与miR-142-3p的种子序列吻合。双荧光素酶报告基因结果证实了miR-142-3p与TCF7的3‘UTR区的结合作用，且呈剂量依赖性；利用RT-PCR和Western印迹的方法检测到miR-142-3p能在蛋白表达水平下调TCF7，而不改变TCF7mRNA水平。RT-PCR和Western blot检测结果显示TCF7的mRNA和蛋白水平在结直肠癌细胞株SW480, DLD-1, HCT116, HCT8中较人胚胎肠粘膜细胞株CCC-HIE-2明显升高；与小肠隐窝细胞株IEC-6比较，TCF7的mRNA表达水平在多种肿瘤细胞中上调，其中在人乳腺癌细胞株M231、T47D中表达水平最高；在人乳腺细胞株HBL-100、MCF-7中有中度表达；在胃癌SGC-7901细胞株中相对较低；TCF7在结直肠癌组织中mRNA表达水平较正常肠粘膜组织明显升高；免疫组化分析显示TCF7在结直肠癌组织中表达为+++，在癌旁组织中表达为++，而在正常肠粘膜组织为+。3. miR-142-3p过表达载体和沉默载体的构建和稳定转染单克隆细胞株的建立：本部分实验利用pPG/miR/eGFP/Blasticidin质粒成功构建了pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-142-3p表达载体、pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-142-3p-Silencer沉默载体和pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miRNA-NC三个载体；经酶切、测序鉴定，证实载体构建成功；将这些载体转染进入SW480细胞株，在荧光显微镜下观察到绿色荧光；并筛选出稳定转染的单克隆细胞株；RT-PCR和western blot结果证实pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-142-3p能抑制靶基因TCF7的表达，而pPG/miR/eGFP/Blasticidin-miR-142-3p-Silencer显著提高了TCF7的表达，转染效率满意。4. MiR-142-3p对SW480细胞生物学行为影响的实验研究：CCK8及克隆形成实验显示，miR-142-3p过表达后，肠癌SW480细胞增殖能力减弱，而miR-142-3p沉默后，肠癌SW480细胞增殖能力明显增强，克隆形成率增高（20.73%vs54.47%）；细胞周期及凋亡检测结果显示，miR-142-3p过表达后，肠癌SW480细胞周期多处于G1前期（62.55.7%）；而miR-142-3p沉默后，肠癌SW480细胞周期多处于S（18.02.2%）、M（76.23.9%）等分裂期。而未处理SW480细胞（正常对照）及NC（阴性对照）组肠癌细胞各周期分布较均匀。5-Fu药物毒性实验结果提示：5-Fu对各组细胞增殖都有抑制作用，各组细胞处于分裂期的细胞数比例减少，G1前期细胞比例增加，且各组都出现不同比例的凋亡细胞。但比较各组的抑制程度可见，miR-142-3p沉默后的肠癌SW480细胞株对5-Fu药物敏感性最低，耐药性相对较高，凋亡细胞比例最低（5.70.9%）；而miR-142-3p过表达后的SW480细胞对5-Fu敏感性最高，凋亡细胞占比最高（25.42.8%）。裸鼠成瘤实验中，miR-142-3p沉默后的肠癌SW480细胞成瘤能力较对照组明显增强，成瘤率100%，成瘤时间早，肿瘤体积和质量均较对照组大。而miR-142-3p过表达的SW480细胞成瘤率减弱（62.5%），成瘤时间晚，肿瘤体积质量也明显偏小。对移植瘤的免疫组化分析结果提示：miR-142-3p沉默后的肠癌细胞移植瘤组织中，靶基因TCF7和RAC1表达明显升高，Ki67及CyclinD1的表达也明显上调。结论MiR-142-3p可能是结直肠癌抑制因子，在肠癌发生过程中，miR-142-3p参与Wnt信号通路，通过对靶基因TCF7的抑制，进而抑制通路下游KI67、Survivin、C-myc、CyclinD1等癌相关基因的表达，从而抑制肠癌细胞的分裂增殖及成瘤能力、促进肠癌细胞凋亡，发挥抑制肿瘤的作用。miR-142-3p可能对肠癌的生物学行为有重要的调控作用。