番茄细菌性溃疡病菌血清学、PCR检测技术及其遗传多样性的研究

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本文针对番茄细菌性溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,简称Cmm)的血清学、PCR检测方法和该病菌的遗传多样性做了了研究,主要研究结果如下:用Cmm的菌体蛋白免疫家兔制备出该病菌的特异性抗血清,琼脂双向扩散法测定其效价为1:80。该抗血清经饱和硫酸铵沉淀、盐析、葡聚糖凝胶过滤层析纯化后能检测出Cmm的样品,而不与Clavibacter michiganense subsp.Sepedonicum、Clavibactermichiganense subsp.insidiosum发生反应。通过与Agdia公司研制的Cmm的ELISA试剂盒比较,证明该研究的间接ELISA法检测特异性比ELISA试剂盒要高,时间更短,灵敏度相同,可应用于田间检测或室内检测。用常规PCR方法和实时荧光PCR方法分别检测Cmm菌悬液和田间采集的病组织,结果表明,常规PCR方法检测灵敏度为105cfu/mL;TaqMan探针实时荧光PCR方法检测检测灵敏度为103-4cfu/mL,比传统PCR方法检测灵敏度(105cfu/mL)提高10-100倍,且不需要琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色和Southern杂交。用Rep-PCR法分析收集的33个番茄溃疡病菌菌株,结果表明,用BOX引物分别扩增出8-15条多态性条带,分子量大小200-3000bp,大多数主要集中在500-2800bp之间;指纹图谱分析结果为:在遗传距离为0.18时,测试的33个菌株可划分为Ⅰ组群、Ⅱ组群、Ⅲ组群、Ⅳ组群、Ⅴ组群、Ⅵ组群和Ⅶ组群7个遗传相似组群,其中Ⅵ组群包含的菌株最多,表明我国番茄细菌性溃疡病菌菌株具有丰富的DNA多态性和较大的遗传变异,同时明番茄溃疡病菌的遗传分群与菌株的地理来源有一定相关性,但与该病在发病的年份几乎无差别。
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