论文部分内容阅读
研究背景丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)是一种主要经过血液传播的嗜肝性病毒,其慢性感染可引起慢性丙型肝炎,进而可导致肝硬化或肝细胞癌。据WHO统计,全球丙型肝炎病毒(HCV)感染者约1.7亿(感染率约为3%),我国HCV感染率为3.2%,且感染率仍有逐年上升的趋势。然而HCV感染治疗的手段有限,主要依靠α-干扰素,及以α-干扰素为主体再附加其他辅助手段。目前也还没有有效疫苗,使得HCV感染成为一个重要的社会问题。尽管科学研究受到广泛的重视,但HCV感染的分子机制还有许多不清楚,从而影响了临床丙肝病毒感染的治疗手段的发展。HCV属黄病毒科丙型肝炎病毒属。HCV编码多个结构蛋白和非结构蛋白,其中NS5A是一个重要的非结构蛋白。它有两种磷酸化形式：p56和p58,它们均可以与宿主内多种信号蛋白发生作用。近来的研究发现NS5A与胰岛素信号通路(Insulin/PI3K/Akt通路)之间存在关联。而胰岛素信号通路在细胞代谢、细胞周期调控、细胞生长凋亡等多种生物学过程中发挥着重要的作用。这意味着NS5A可能通过改变胰岛素信号通路,从而在HCV感染过程中发挥其作用。在正常情况下这条信号通路受到严格的调控,其稳态的变化与不同疾病的发生相联系。当Insulin/PI3K/Akt信号通路中的关键分子PI3K(调节亚基p85和催化亚基p110)、Akt等编码基因的功能发生改变,可导致细胞代谢障碍、细胞周期及细胞生长凋亡紊乱而引起各种疾病,例如肿瘤。HCV蛋白NS5A可结合并激活PI3K,导致下游分子丝氨酸/苏氨酸激酶,即Akt/蛋白激酶B的激活,破坏了信号通路在体内的稳态,导致HCV感染的细胞持续增殖而引发一系列病理效应,包括抗病毒抗性的产生[4-5]、肝细胞癌发生等[6-7]。PTEN是除p53之后一个重要的抑癌基因。该基因功能的降低与多种组织的肿瘤发生有关。曾有研究报道丙肝导致的肝癌中,PTEN的功能降低。而PTEN是胰岛素信号的主要负调节因了,抑制Insulin/PI3K/Akt信号,从而与HCV激活Insulin/PI3K/Akt信号作用相对抗。本论文研究了抑癌基因PTEN与细胞胰岛素信号通路稳态的关系,及HCV蛋白NS5A对细胞胰岛素信号通路稳态的破坏作用,显示了PTEN与NS5A从正反两个方面影响胰岛素信号通路,通过改变该信号通路的稳态,从而影响细胞的命运。第一部分PTEN对Insulin/PI3K/Akt信号通路稳态的作用[目的]既然,丙肝肝癌中,PTEN的功能减弱。因此,我们首先研究PTEN与Insulin/PI3K/Akt稳态的关系。我们以人肝癌细胞系HepG2为研究模型,用胰岛素刺激、或上调或沉默PTEN的表达等,利用Western blot技术,从蛋白水平层面研究Insulin/PI3K/Akt信号通路的稳态变化。[方法]1、常规培养HepG2细胞传代均匀铺十二孔板,待长至约90%后,予血清饥饿24小时后裂解细胞。裂解细胞前予insulin刺激10min(胰岛素工作浓度为2ul/ml,用无血清DMEM液稀释)或加入同体积的无血清DMEM培养液作对照,分为insulin刺激组或control组,裂解细胞提取总蛋白,Western blot蛋白分析法检测p-Akt蛋白表达水平。2、常规培养的HepG2细胞根据转染携带人野生型PTEN的真核表达质粒(pSvEGFP-PTEN)或磷酸酶域突变型质粒pSvEGFP-C124S两种不同质粒分为两组,即PTEN wt组及PTENC124S组,转染、血清饥饿同上。两组均予等量等浓度胰岛素刺激10min后裂解细胞,提取总蛋白。Western blot蛋白分析检测p-Akt蛋白表达水平。3、常规培养的HepG2细胞根据转染PTEN siRNA及其control siRNA分为两组,即PTEN siRNA组及control组,转染、血清饥饿及胰岛素刺激同上。转染共48小时后常规裂解细胞,提取总蛋白。Western blot蛋白分析法检测PTEN及p-Akt两种蛋白表达水平。4、所有结果经Excel2010及SPSS13.0统计软件分析,数据以“算术平均值±标准误(M±S.E.M)”表示。两组间比较采用独立样本t检验(Independent-Samples T Test)或两个独立样本比较的Wilcoxon秩和检验,以P值<0.05视为有显著性差异。[结果]1、Western blot检测结果显示insulin刺激组较control组p-Akt蛋白表达水平显著提高(P<0.010), Western blot以β-actin作内参,两组灰度比值比分别为0.221±0.136及0.000+0.000。2、Western blot检测结果显示PTENC124S组较PTEN wt组Akt磷酸化水平有所提高(灰度比值比分别为0.360±0.141和0.084±0.055,P<0.05)。3、Western blot检测结果显示PTEN siRNA组比control组HepG2细胞PTEN蛋白表达水平偏低(P<0.05),相应的p-Akt蛋白表达水平却相对显著提高(P<0.005)。[结论]1、胰岛素可以诱导Insulin/PI3K/Akt信号通路的激活。2、当Insulin/PI3K/Akt信号通路中某一环节如负调控因子PTEN基因点突变或敲低,可引起下游信号分子Akt活化。3、在正常情况下Insulin/PI3K/Akt信号通路受到严格的调控,外源性干预使信号通路中任一环节受阻或失控,这一稳态将被打破,或过度抑制或过度激活。第二部分HCV蛋白NS5A在Insulin/PI3K/Akt信号通路中的作用[目的]上一部分显示,PTEN对Insulin/PI3K/Akt稳态的作用。接着,我们研究NS5A对Insulin/PI3K/Akt的影响。我们将丙肝病毒NS5A质粒导入Insulin/PI3K/Akt信号通路活跃的人肝癌细胞系HepG2细胞中,从蛋白水平探求丙肝病毒(HCV)蛋白NS5A对于PI3K/Akt通路的调控作用及其初步机制,为临床上丙肝慢性迁延、肝细胞癌发生及抗病毒抗性等方面提供依据。[方法l1、HepG2细胞分别转染NS5A质粒或对照空载体,转染相应质粒24小时后血清饥饿。转染共48小时后胰岛素刺激10min即常规裂解细胞提取总蛋白。以p-Akt抗体为一抗,Western blot检测Akt磷酸化水平。2、常规培养的HepG2细胞根据转染NS5A质粒或对照空载体两组不同质粒分为NS5A组及control组,转染48小时后常规裂解细胞提取总蛋白。采用免疫沉淀法检测：将NS5A组或control组HepG2细胞总蛋白先与PI3K调节亚基p85多克隆抗体进行免疫沉淀,再以anti-pTyr为Western blot抗体检测,比较两组间p85酪氨酸磷酸化水平。3、常规培养HepG2细胞根据转染NS5A质粒或对照空载体两组不同质粒分为NS5A组及control组,转染48小时后常规裂解细胞提取总蛋白。采免疫共沉淀法检测：将NS5A组或control组HepG2细胞总蛋白先与PI3K催化亚基p85多克隆抗体进行免疫沉淀,再以anti-p110为Western blot抗体检测,比较两组间催化亚基p110与调节亚基p85的结合水平。4、所有结果经Excel2010及SPSS13.0统计软件分析,数据以“算术平均值±标准误(M±S.E.M)”表示。两组间比较采用独立样本t检验(Independent-Samples T Test)或两个独立样本比较的Wilcoxon秩和检验,以P值<0.05视为有显著性差异。[结果]1、Western blot检测结果显示NS5A质粒转染组HepG2细胞p-Akt蛋白水平较control组明显上调(灰度比值比分别为0.811±0.131及0.205+0.066,P<0.002)。2、免疫沉淀法检测到NS5A质粒转染组的p85酪氨酸磷酸化水平较control组的高(灰度比值比分别为1.055+0.189及0.479+0.147,<0.014)。3、免疫共沉淀法检测结果显示NS5A质粒转染组与control组细胞的p85和p110蛋白结合无差异(灰度比值比分别为0.543+0.286及0.195,P>0.05)。[结论]HCV蛋白NS5A可以与PI3K调节亚基p85蛋白相互作用,进而激活Insulin/PI3K/Akt信号通路,但HCV蛋白NS5A与p85蛋白间的相互作用并没有影响到PI3K调节亚基p85和催化亚基p110间的结合。HCV蛋白NS5A激活P13K信号通路,可能不是通过经典途径发生,而是通过其他途径。这可能提示着,HCV对胰岛素信号通路的影响的另一机制,正是通过影响PTEN的途径。